朱國(guó)強(qiáng)，王水興*，黃 蘭，朱石龍

(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047)

麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶在畢赤酵母中的表達(dá)及活性分析

朱國(guó)強(qiáng)，王水興*，黃 蘭，朱石龍

(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047)

用PCR方法從E.coli BL21(DE3)中獲得麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶基因，將該基因插入到酵母表達(dá)載體pPIC9K的α分泌信號(hào)開放閱讀框的下游，對(duì)重組質(zhì)粒pPIC9K-MalQ所含的外源片段進(jìn)行雙向測(cè)序。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒用內(nèi)切酶SalⅠ線性化，電穿孔轉(zhuǎn)化到GS115感受態(tài)細(xì)胞中，G418梯度篩選高拷貝轉(zhuǎn)化菌及PCR鑒定目的基因的整合，1%甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)薄層色譜分析粗酶液處理的麥芽二糖溶液，證實(shí)粗酶液具有麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶活性。

麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶；畢赤酵母；基因重組

麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶(amylomaltase)存在于古生菌[1]、細(xì)菌[2]及一些植物[3-4]中，參與麥芽糖的代謝利用[5]，淀粉為底物生成熱可逆性凝膠或環(huán)狀糊精[6]。熱可逆性凝膠可以取代明膠，有效地解決淀粉回生問(wèn)題；環(huán)狀糊精具有筒狀疏水內(nèi)腔和親水外表，可以和多種疏水性客體分子形成包合物，從而改變客體分子的水溶性、穩(wěn)定性、反應(yīng)性，因此環(huán)狀糊精可應(yīng)用于食品、化學(xué)及醫(yī)藥工業(yè)。由此可見，這兩種物質(zhì)都具有很好的商業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

現(xiàn)在工業(yè)中所用的環(huán)狀糊精主要是聚合度分別為6、7、8的α-、β-、γ-環(huán)糊精及其衍生物，其中以β-環(huán)糊精應(yīng)用最為廣泛。而大環(huán)糊精是指一種聚合度(指葡萄糖分子的數(shù)目)從9到幾百不等的環(huán)狀葡聚糖，比α-、β-、γ-環(huán)糊精具有更大的筒狀內(nèi)腔，包合能力更強(qiáng)，可以包合多種分子質(zhì)量的分子[7]，且大環(huán)糊精具有高水溶性。由于大環(huán)糊精可以與更多的疏水性物質(zhì)形成包合物，因而應(yīng)用范圍更廣。麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶是合成大環(huán)糊精的一種酶，具有催化分子間和分子內(nèi)的糖基轉(zhuǎn)移作用，反應(yīng)式如下：

(α-1,4 glucan)m+(α-1,4 glucan)n→(α-1,4 glucan)m-x+ (α-1,4 glucan)n+x(1) (α-1,4 glucan)n→cyclic(α-1,4 glucan)x+(α-1,4 glucan)n-x(2)

在反應(yīng)式(2)中，麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶可以把直鏈淀粉環(huán)化成含10～50個(gè)葡萄糖殘基的大環(huán)糊精[8-12]。Terada等[10]在E.coli中成功表達(dá)了來(lái)自Thermus aquaticus ATCC 33923的麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶基因(MalQ基因)，將獲得的酶作用于直鏈淀粉，證實(shí)了該酶能催化分子內(nèi)的糖基轉(zhuǎn)移而生成大環(huán)糊精。

本研究從E.coli BL21(DE3)中克隆得到MalQ基因，構(gòu)建了畢赤酵母分泌型表達(dá)菌株，重組菌經(jīng)培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)后，提取粗酶液，薄層色譜檢測(cè)表明，粗酶液具

有麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶活性，旨在為利用麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶來(lái)制備大環(huán)糊精及應(yīng)用該酶生產(chǎn)熱可逆性凝膠提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

宿主菌與質(zhì)粒：E.coli BL21(DE3)與E.coli DH5α本實(shí)驗(yàn)室保存，畢赤酵母菌株GS115與質(zhì)粒pPIC9K由南昌大學(xué)的黃國(guó)俊教授提供。

pfu DNA聚合酶、T4DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶(Not Ⅰ、EcoRⅠ、SalⅠ) TaKaRa公司(大連)。引物(UP 5＇CGGAATTCATGGAAAGCAAACGTCTGG 3＇，下劃線為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)；LP 5＇ATAAGAATGCGGC CGCGCATCAACCGCACTCTACT 3＇，下劃線為Not Ⅰ酶切位點(diǎn)) 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

Gene Amp PCR system 2400型 PCR擴(kuò)增儀 美國(guó)PE公司；FR-2000凝膠成像系統(tǒng) 上海夏日科技有限公司；DYY-Ⅲ型穩(wěn)壓電泳儀 北京六一儀器廠；Bio-Rad電轉(zhuǎn)儀 Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 PCR擴(kuò)增MalQ基因

根據(jù)GenBank中報(bào)道的E.coli BL21(DE3)的MalQ基因序列，用Olige6.0軟件設(shè)計(jì)帶有與pPIC9K 的MCS上相同酶切位點(diǎn)的引物，并以E.coli BL21(DE3)基因組DNA為模板，擴(kuò)增MalQ基因。PCR擴(kuò)增程序：98℃5min；98℃ 10s，60 ℃ 5s，72℃ 2.5min，共30個(gè)循環(huán)；72℃ 10min。

1.3.2 pPIC9K-MalQ重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將PCR產(chǎn)物和pPIC9K質(zhì)粒用EcoRⅠ及Not Ⅰ雙酶切，瓊脂糖電泳回收純化，用T4DNA ligase進(jìn)行連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物熱休克轉(zhuǎn)化菌E.coli DH5α，培養(yǎng)于氨芐青霉素的LB平板上，挑取陽(yáng)性克隆子，提取質(zhì)粒，酶切鑒定含有MalQ基因的重組子送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.3.3 酵母菌的轉(zhuǎn)化和高拷貝整合菌株的篩選

在80μL酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞中加入用SalⅠ線性化的重組質(zhì)粒DNA 10μL(約5～20μg)，迅速加入冰預(yù)冷的0.2cm電擊杯中，在冰上放置5min，根據(jù)所使用裝置推薦的釀酒酵母參數(shù)進(jìn)行電擊，迅速加入1mL預(yù)冷的山梨醇，將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至滅菌的1.5mL離心管中，取200μL涂布于MD平板，30℃培養(yǎng)至克隆產(chǎn)生。再將MD平板上生長(zhǎng)的陽(yáng)性克隆分別轉(zhuǎn)種至G418質(zhì)量濃度為0.25、0.5、1.0、2.0、4.0g/L的YPD平板上，在高質(zhì)量濃度YPD-G418平板上生長(zhǎng)的菌落為高拷貝整合菌株[13]。

1.3.4 高拷貝整合菌株的PCR鑒定

挑取高拷貝整合單菌落接種于10mL YPD培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)18h，采用反復(fù)凍融法[14]制備酵母PCR模板，用UP和LP引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR條件與1.3.1節(jié)相同。

1.3.5 工程菌株的誘導(dǎo)表達(dá)

將PCR鑒定為陽(yáng)性的菌株，接種于25mL BMGY培養(yǎng)基中，28℃、200r/min培養(yǎng)至OD600nm為5～6，4000r/min離心收集菌體，加入20mL BMGY重懸培養(yǎng)，每隔2h加入終體積分?jǐn)?shù)為1%的甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。

1.3.6 酶活力測(cè)定

采用葡萄糖氧化酶法測(cè)定酶活，10μL反應(yīng)液加入1mL葡萄糖測(cè)定試劑盒工作液，37℃水浴15min后，于505nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，參照葡萄糖含量-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線可求酶活，具體操作見葡萄糖測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(上海榮盛生物技術(shù)有限公司)。

1.3.7 TLC分析糖基轉(zhuǎn)移酶活性

取粗酶液100μL加入到900μL 1g/100mL的麥芽二糖溶液中，37℃溫育30min，100℃水浴5min滅酶活，12000r/min離心5min，上清用TLC分析，以正丁醇-乙酸-蒸餾水(體積比5:4:11)為展開劑，濃硫酸-乙醇(體積比1:1)為顯示劑，噴霧顯色劑后，120℃烘烤10min。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增MalQ基因

經(jīng)PCR擴(kuò)增，電泳驗(yàn)證獲得約2.1kb的基因片段，與目的基因片段大小一致，結(jié)果見圖1。

圖1 目的片段PCR擴(kuò)增結(jié)果(目的片段約2.1kb)Fig.1 PCR amplification ofMalQ gene

2.2 pPIC9K-MalQ重組質(zhì)粒的獲得及電泳驗(yàn)證

將PCR產(chǎn)物和pPIC9K質(zhì)粒用EcoRⅠ及Not Ⅰ雙酶切，瓊脂糖電泳回收純化，用T4DNA ligase進(jìn)行連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物熱休克轉(zhuǎn)化菌E.coli DH5α，培養(yǎng)于氨芐青霉素的LB平板上。

挑取氨芐青霉素平板上的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，雙酶切得到兩條條帶，一條與目的片段大小相符，另一條與質(zhì)粒pPIC9K分子質(zhì)量相符，由此可以初步判斷獲得了陽(yáng)

性重組質(zhì)粒。將酶切驗(yàn)證正確的陽(yáng)性克隆送上海生工測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST比對(duì)，與GenBank中報(bào)道的E.coli BL21(DE3) MalQ基因的同源性為100%。重組質(zhì)粒雙酶切結(jié)果見圖2。

圖2 陽(yáng)性重組質(zhì)粒雙酶切分析Fig.2 Restriction enzyme analysis of recombinant plasmid pPIC9KMalQ

2.3 GS115的轉(zhuǎn)化和高拷貝整合菌株的篩選

SalⅠ線性化的pPIC9K-MalQ質(zhì)粒轉(zhuǎn)化GS115感受態(tài)細(xì)胞，在MD平板上培養(yǎng)3d，共得到47個(gè)His＋轉(zhuǎn)化菌落，與空載體的轉(zhuǎn)化效率沒有明顯差別。將pPIC9K-MalQ轉(zhuǎn)化的His＋菌落、空載體轉(zhuǎn)化菌和GS115逐個(gè)點(diǎn)種至不同質(zhì)量濃度的YPD-G418平板上，在0.25g/L YPD-G418的平板上所有His＋菌生長(zhǎng)無(wú)差異，GS115生長(zhǎng)緩慢；而當(dāng)G418質(zhì)量濃度在0.5、1.0、2.0g/L時(shí)，GS115不生長(zhǎng)，His＋菌生長(zhǎng)速度出現(xiàn)差異；4.0g/L的YPD-G418平板上無(wú)His＋菌生長(zhǎng)。在2.0g/L的YPD-G418平板上共得到4個(gè)生長(zhǎng)速度較快的大菌落，估計(jì)是高拷貝菌株。

2.4 PCR鑒定高拷貝整合菌株

挑取在2.0g/L YPD-G418平板上生長(zhǎng)的4個(gè)菌落，經(jīng)原位PCR驗(yàn)證，均擴(kuò)增得到分子質(zhì)量為約2.1kb大小的片段，表明MalQ基因已成功整合到畢赤酵母的染色體中，PCR結(jié)果見圖3。

圖3 PCR鑒定目的基因的整合Fig.3 PCR identification of target gene integration

2.5 酶活力測(cè)定

一個(gè)酶活力單位定義為在如下反應(yīng)條件中每分鐘產(chǎn)生1 μ mol/L的葡萄糖所需的粗酶液量。于900 μ L 1g/100mL的麥芽二糖溶液中加入100μL粗酶液，37 ℃反應(yīng)30min，反應(yīng)結(jié)束后沸水浴10min滅活酶，反應(yīng)產(chǎn)生的葡萄糖采用葡萄糖氧化酶法測(cè)定，得粗酶液的酶活為118U。

2.6 麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶活性分析

用1g/100mL的麥芽糖與粗酶液在37℃反應(yīng)30min，經(jīng)高速離心處理，上清經(jīng)薄層分析，結(jié)果見圖4，可以看出當(dāng)以麥芽糖為底物時(shí)，由基因工程菌誘導(dǎo)表達(dá)得到的粗酶液能夠?qū)⑻腔D(zhuǎn)移生成葡萄糖、麥芽三糖、四糖、五糖，證明粗酶液具有麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶活性。

圖4 薄層分析酶促反應(yīng)液Fig.4 TLC analysis of enzymatic reaction mixture

3 討 論

麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶是作用于淀粉生產(chǎn)熱可逆性凝膠和環(huán)狀糊精關(guān)鍵酶制劑，在食品、化工及醫(yī)藥行業(yè)具有很好的開發(fā)前景。麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶具有催化分子內(nèi)的糖基轉(zhuǎn)移作用，使直鏈淀粉環(huán)合生成大環(huán)糊精，近年來(lái)，越來(lái)越多的科學(xué)家利用麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶的這一作用，開展大環(huán)糊精的制備研究。但該酶在微生物和一些植物中的含量很低，直接提取該酶都難以滿足研究和應(yīng)用的要求，必須通過(guò)基因工程技術(shù)來(lái)表達(dá)該酶。一些麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶基因已在大腸桿菌中得到表達(dá)，以大腸桿菌作為宿主表達(dá)麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶，雖然發(fā)酵時(shí)間短，表達(dá)水平較高，但表達(dá)產(chǎn)物通常以包涵體的形式存在[15]，無(wú)活性，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。本實(shí)驗(yàn)首次采用畢赤酵母表達(dá)麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶，畢赤酵母作為真核生物，不僅具有其他高等真核表達(dá)系統(tǒng)的許多優(yōu)點(diǎn)，如蛋白加工、折疊、翻譯后修飾等，且操作時(shí)與E.coli及釀酒酵母同樣簡(jiǎn)單，通過(guò)將麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶基因插入到含有AOX1基因啟動(dòng)子和α分泌信號(hào)肽的畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K中，轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主菌GS115，G418梯度篩選轉(zhuǎn)化菌，從而得到整合了多拷貝基因的工程菌，甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物可以直接分泌到培養(yǎng)液中，經(jīng)薄層色譜分析，證實(shí)培養(yǎng)液具有麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶活性。因畢赤酵母只分泌很少的自身蛋白，所以分泌的外源蛋白

是培養(yǎng)基中蛋白的主要成分，有利于蛋白的純化，比大腸桿菌融合表達(dá)的蛋白純化更加方便，因此利用畢赤酵母表達(dá)麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶，為工業(yè)化生產(chǎn)和純化該酶提供了極大的方便，也為大環(huán)糊精的制備打下了基礎(chǔ)。

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Expression and Activity Assay of Amylomaltase in Pichia pastoris

ZHU Guo-qiang，WANG Shui-xing*，HUANG Lan，ZHU Shi-long
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047,China)

The gene of MalQ was amplified from genomic DNA of E. coli BL21(DE3) and subcloned intoα secretion signal open reading frame of pPIC9K expression vector to obtain a recombinant plasmid pPIC9K-MalQ. The recombinant plasmid was verified by DNA sequence. The resultant recombinant plasmid bearing MalQ gene was digested by Sal I and transformed into Pichia pastoris strain GS115. The cells with stable expression of amylomaltase were screened in the medium containing G418. The positive clones were induced with methanol to express amylomaltase. The activity of 4-α-glucanotransferase in the crude enzyme was validated through TLC.

amylomaltase；Pichia pastoris；gene recombination

Q786

A

1002-6630(2010)23-0258-04

2010-08-14

朱國(guó)強(qiáng)(1984—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)榉肿由飳W(xué)。E-mail：zhuguo0716@yahoo.com.cn

*通信作者：王水興(1965—)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：shuixingw@yahoo.com.cn