魯振強，陳艷平，馬龍彪，佟清越，陳連江

（1.黑龍江省普通高等學校生化與分子生物學重點實驗室/黑龍江大學生命科學學院，哈爾濱150080；2.黑龍江省普通高等學校甜菜遺傳育種重點實驗室/黑龍江大學農(nóng)作物研究院，哈爾濱150080）

甜菜轉(zhuǎn)基因體系的相關(guān)影響因素研究

魯振強1，陳艷平1，馬龍彪2，佟清越1，陳連江2

（1.黑龍江省普通高等學校生化與分子生物學重點實驗室/黑龍江大學生命科學學院，哈爾濱150080；2.黑龍江省普通高等學校甜菜遺傳育種重點實驗室/黑龍江大學農(nóng)作物研究院，哈爾濱150080）

以16種基因型的二倍體甜菜（Beta vulgaris L.）為材料，建立并優(yōu)化了甜菜的植株再生體系；對影響甜菜轉(zhuǎn)基因的相關(guān)因素進行了比較分析，確定了抗生素標記基因的適宜篩選濃度為200 mg/L；菌液適宜浸染濃度OD600為0.3；浸染最適時間為10 min；外植體與農(nóng)桿菌適宜共培養(yǎng)時間為4 d；添加乙酰丁香酮的適宜濃度為100μmol/L。研究結(jié)果的獲得，為完善甜菜的遺傳工程以及甜菜基因組學的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

甜菜；轉(zhuǎn)基因；遺傳改良

甜菜（Beta vulgaris L.）為藜科甜菜屬，具有二年生異花授粉習性，是我國的主要糖料作物。根據(jù)甜菜的生長特性和用途可分為糖用、飼用和葉用型甜菜[1］。常規(guī)的甜菜育種主要采取系譜選擇、理化誘變等方法培育新品種，缺點是周期長，定向選擇性差，效率低。同時，甜菜基因的高度雜合性，難以建立高效的植株再生體系，不同基因型甜菜之間的再生差別較大，使得其遺傳轉(zhuǎn)化相對困難。基因工程育種以培養(yǎng)細胞為基礎(chǔ)，具有目的性強、育種周期短等優(yōu)點，為甜菜新品種的培育提供了新的手段。但是，轉(zhuǎn)基因技術(shù)作為一項新方法，其在甜菜上的研究及應用相對滯后，亟待解決[2,3］。

基于以上的背景以及甜菜基因組學研究的需求，我們在篩選了大量基因型的甜菜后，確定了16種為試材，建立并優(yōu)化了甜菜的植株再生體系；探索了甜菜轉(zhuǎn)基因的相關(guān)影響因素，分別從抗生素標記基因的定量選擇，基因、外植體和受體類型的差異影響，預培養(yǎng)、共培養(yǎng)等影響因素的篩選，對甜菜轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)化條件和方法進行了比較研究。

1 材料與方法

1.1 材料

16種基因型甜菜（Beta vulgaris L.）種子，由馬龍彪、王華忠老師友情提供，品種名稱分別為：08-1至08-10計10個，2B027、2B042、2B049、2B796、2B807、S-08計6個，種植于黑龍江大學溫室及實驗田。根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105（RifR）和構(gòu)建好的植物表達載體pBI121-OsAPX3（CaMV35S啟動子，卡那霉素標記基因，KanaR），由本實驗室保存。

1.2 外植體的選擇

選取08-4甜菜無菌苗的葉柄、葉片、子葉、下胚軸為外植體，分別剪成0.5～1cm長的小段，接種于不定芽誘導培養(yǎng)基中，每瓶接種7～8塊，篩選誘導率較高的外植體。

1.3 主要試劑

常用生化試劑、植物激素、培養(yǎng)基成分均為國產(chǎn)分析純。

1.4 轉(zhuǎn)基因體系的實驗設(shè)計

卡那霉素濃度的設(shè)計：分別配制含50，100，200，500，1000 mg/L卡那霉素的叢生芽誘導培養(yǎng)基和不定芽誘導培養(yǎng)基，10d為繼代周期，連續(xù)繼代3次后統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

農(nóng)桿菌浸染條件：挑取攜帶目的基因的農(nóng)桿菌EHA105單菌落，接種在含抗生素的YEP中，180r/min離心后28℃培養(yǎng)18h，至OD600=0.6時，菌液按1∶10稀釋，取適量菌液于無菌離心管中，3000 r/min離心5min，棄去上清液，沉淀重懸，調(diào)至OD600=0.2～0.6待用。分別設(shè)計浸染菌液濃度OD600值分別為0.2，0.3，0.4，0.5，0.6的5種稀釋菌液中浸染5 min，然后共培養(yǎng)4d，以確定最佳菌液濃度；當OD600值為0.3時，浸染時間分別為1，5，10，20min，然后共培養(yǎng)4d，以確定最佳浸染時間；當OD600值為0.3，浸染時間為5 min時，分別共培養(yǎng)2，4，6，8d，以確定最佳共培養(yǎng)時間；在OD600值為0.3的菌液中加入乙酰丁香酮（AS）的濃度分別為0，50，100，200μmol/L，浸染時間為5 min，然后共培養(yǎng)4d，以確定最佳乙酰丁香酮（AS）的加入濃度。

取再生的甜菜抗性單芽并切下，繼而誘導生根，單株栽培并管理，長成完整植株。

1.5 轉(zhuǎn)基因甜菜的分子檢測

剪取具有卡那霉素抗性、長勢較好的轉(zhuǎn)基因（pBI121-OsAPX3）再生甜菜的幼嫩葉片，提取基因組DNA，以轉(zhuǎn)基因甜菜總DNA為模板，進行PCR鑒定。PCR反應體系為：DNA模板1μL，10×PCR Buffer 2μL，10mM dNTP Mixture 1.6μL，上游引物1μL，下游引物1μL，ddH2O 13.3μL，r Taq 0.1μL。94℃，5min；（94℃，30s；57℃，30s；72℃，1min）×35個循環(huán)；72℃，10min；4℃結(jié)束。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 卡那霉素濃度的篩選

本研究所使用的植物表達載體pBI121具有卡那霉素類的抗生素標記基因，是篩選轉(zhuǎn)基因甜菜的第一步，其濃度的確定是較重要的。Kana濃度過高，會對轉(zhuǎn)化細胞產(chǎn)生毒害，以使其在篩選過程中死亡，從而降低轉(zhuǎn)化效率。而濃度過低，不能對轉(zhuǎn)化體進行嚴格的篩選，會產(chǎn)生假抗性植株，會增加后續(xù)轉(zhuǎn)化植株鑒定的工作量。因此，合適的Kana濃度既能有效抑制非轉(zhuǎn)化細胞的生長，又不影響轉(zhuǎn)化細胞的正常生長。所以在轉(zhuǎn)化之前需先確定Kana的用量，實驗結(jié)果見表1。

從表1中數(shù)據(jù)可以看出，卡那霉素對甜菜葉柄的分化和叢生芽塊的存活都有不同程度的影響。卡那霉素對甜菜生長的抑制作用，隨著濃度的提高不斷增強。當卡那霉素濃度為100 mg/L時，葉柄分化頻率下降為3%；當濃度達到200 mg/L時，叢生芽塊的存活率也僅為13%，濃度繼續(xù)增高時，所有外植體都將枯萎死亡。因此，確定選擇100 mg/L作為轉(zhuǎn)化葉柄外植體的篩選濃度，選擇200 mg/L作轉(zhuǎn)化叢生芽塊的篩選濃度。

2.2 農(nóng)桿菌浸染條件的確定

由農(nóng)桿菌浸染液濃度和外植體染菌率與抗性芽得率的結(jié)果可見，菌液濃度的增加，外植體染菌率也變大，浸染液OD600為0.4、0.5、0.6時，葉柄邊緣形成較大的菌苔，菌的生長不易抑制；當菌液OD600為0.2、0.3時，生長較好，綜合考慮外植體染菌率和抗性芽率，確定OD600為0.3作為適宜浸染菌液濃度。

農(nóng)桿菌浸染甜菜外植體的時間結(jié)果顯示，20min農(nóng)桿菌生長過于旺盛，在葉柄外形成黃色的大菌落，菌的生長無法抑制；浸染時間為1min和5min時，農(nóng)桿菌的生長均得到了有效的抑制，但是抗性芽得率低；而浸染時間為10min時，農(nóng)桿菌的生長得到了一定的控制，而且有較高的抗性芽率；考慮到確保農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的成功，確定10min作為適宜浸染時間。

由共培養(yǎng)天數(shù)對甜菜葉柄遺傳轉(zhuǎn)化的結(jié)果可見，共培養(yǎng)8d時，染菌率高達62.7%，嚴重影響了甜菜外植體的生長，抗性芽得率僅為1.3%。共培養(yǎng)1d的外植體，染菌率不高，但是抗性芽得率也很低，只有2.7%。經(jīng)過4d共培養(yǎng)的外植體經(jīng)篩選培養(yǎng)，染菌率不是很高，甜菜抗性芽得率為12.0%。甜菜葉柄外植體與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)4d后進行篩選培養(yǎng)獲得的抗性芽最多，效果比較理想。

表1 不同Kana濃度下葉柄不定芽再生率和叢生芽塊存活率

圖1 轉(zhuǎn)OsAPX3基因甜菜的PCR檢測

2.3 乙酰丁香酮的影響

農(nóng)桿菌菌液中加入乙酰丁香酮對甜菜葉柄遺傳轉(zhuǎn)化產(chǎn)生影響，但影響程度不大，加入量為100μmol/L時，抗性芽得率為13.5%，不加的時候，抗性芽得率為10.3%，但是，隨著乙酰丁香酮的增加，甜菜外植體的褐化率不斷升高，當乙酰丁香酮濃度為200μmol/L時，外植體褐化率達到26.3%。所以，添加100μmol/L乙酰丁香酮為適宜濃度。

2.4 轉(zhuǎn)基因甜菜再生植株的分子鑒定

以提取的轉(zhuǎn)基因甜菜再生植株的基因組DNA為模板，進行PCR擴增，結(jié)果如圖1。初步證明外源基因OsAPX3已導入并整合到甜菜基因組中，對所獲得的所有抗性植株均進行了PCR檢測，得到PCR陽性植株6株。

3 討論

甜菜由于它的高度自交不親和性，常使得優(yōu)良基因型非常容易丟失，常規(guī)育種方法難以解決；甜菜轉(zhuǎn)基因相關(guān)技術(shù)的研究及應用相對滯后，進展較緩慢，難以滿足當今甜菜遺傳改良的要求[2-4］。本研究正是基于此，建立并優(yōu)化了甜菜的植株再生體系；探索了甜菜轉(zhuǎn)基因的相關(guān)影響因素。結(jié)果中也發(fā)現(xiàn)，甜菜對卡那霉素的反應較其他植物更為不敏感，在200 mg/L卡那霉素的選擇壓力下仍有部分野生型植株存活，這也提醒我們在未來的植物抗性標記基因的選擇上，要充分考慮到這一點，加以避免。農(nóng)桿菌與甜菜外植體共培養(yǎng)是整個甜菜遺傳轉(zhuǎn)化過程中非常重要的環(huán)節(jié)，因為農(nóng)桿菌的附著以及T-DNA的轉(zhuǎn)移與整合都在共培養(yǎng)時完成，因此共培養(yǎng)時間的把握是甜菜基因轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。農(nóng)桿菌在轉(zhuǎn)化甜菜時，它本身并不侵入到植物細胞中去，而是把目的基因轉(zhuǎn)移到甜菜細胞中。菌液附著甜菜外植體后并不能立刻轉(zhuǎn)化，只有在甜菜創(chuàng)傷部位生活一定時間之后的菌株才可以誘發(fā)腫瘤，這一段時間稱之為調(diào)節(jié)期，因此，農(nóng)桿菌與甜菜外植體共培養(yǎng)時間不能太短。但是如果共培養(yǎng)時間過長，就會使后續(xù)培養(yǎng)過程中難以抑制農(nóng)桿菌的生長。

同時，乙酰丁香酮并非甜菜轉(zhuǎn)基因的必需條件，過量的添加致使再生組織的褐化更為嚴重；對于供試的基因型、外植體類型間的差異，仍是限制當前甜菜遺傳轉(zhuǎn)化的很大因素。愈傷組織的誘導可以達到較高的頻率，但是關(guān)于愈傷組織的細胞調(diào)控，仍有待進一步的深入探索。較為樂觀的是，預培養(yǎng)、共培養(yǎng)等轉(zhuǎn)化條件和方法經(jīng)過比較研究，已經(jīng)達到預期，為后期甜菜的轉(zhuǎn)基因應用以及基因組學研究，提供了技術(shù)保障。

[1］中國農(nóng)業(yè)科學院甜菜研究所.中國甜菜栽培學[M］.北京:農(nóng)業(yè)出版社，1982，81-114.

[2］孫亞卿，邵金旺，張少英.甜菜基因工程研究進展及其展望[J］.中國農(nóng)學通報，2007，23（4）:27-32.

[3］杜昕鈺.轉(zhuǎn)RIPs基因甜菜T1代的遺傳穩(wěn)定性與抗病生理特性鑒定[D］.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學，2009:4-6.

[4］李玉萍.基因工程在甜菜育種中的研究現(xiàn)狀[J］.河北農(nóng)業(yè)科學，2009，13（2）:55-57.

Related Impact Factors on Transgene System of Sugarbeet

LU Zhen-qiang1,CHEN Yan-ping1,MA Long-biao2,TONG Qing-yue1,CHEN Lian-jiang2
(1.Key Lab of Biochemistry and Molecular Biology/College of Life Sciences Heilongjiang University,Harbin 150080,China; 2.Key Lab of Crop Genetics and Breeding/Institute for Crop Research,Heilongjiang University,Harbin 150080,China)

Sugarbeet（Beta vulgaris L.）varieties including 16 kinds genotype were chosen,its plant generation system was established and optimized,and related factors on genetic transformation were compared and analyzed as well.In this study,optimal dose of Kanamycin 200 mg/L was identified;optimal infected Agrobacterium tumefaciens EHA105-OsAPX3 was OD600=0.3;and the optimal infected internal was 10min;the optimal explants co-cultured with agrobacterium was 4 days;the optimal concentration of acetosyringone added was 100μmol/L.The results would make full usage ofgenetic transformation and genome on sugarbeetin the future.

Sugarbeet（Beta vulgaris L.）;Gene transformation;Genetic improvement

S566.303；Q78

A

1007-2624（2010）03-0001-03

2010-05-28

中國博士后科學基金面上資助項目（20080440918）；黑龍江省博士后基金資助項目（LBH-Z07029）；黑龍江省教育廳資助項目（11521222）；黑龍江大學青年基金項目（QL200526）。

魯振強（1968-），男，博士，碩士生導師。主要從事植物基因組研究。Tel:0451-86608243;E-mail:zhenqianglu@163.com

陳連江，研究員，黑龍江大學農(nóng)作物研究院。