周曉坤，陳 鈞,*，韓邦興,2，何 佳，劉長風(fēng)

(1.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.植物細(xì)胞工程安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽 六安 237012)

水菖蒲內(nèi)生菌分離與抗菌活性菌株篩選

周曉坤1，陳 鈞1,*，韓邦興1,2，何 佳1，劉長風(fēng)1

(1.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.植物細(xì)胞工程安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽 六安 237012)

對水菖蒲內(nèi)生真菌進(jìn)行分離，并進(jìn)行抗菌活性的篩選。采用改良氯化三苯四氮唑顯色(TTC)微量稀釋法篩選抗菌活性菌株。以18種常見導(dǎo)致食品腐敗的細(xì)菌、酵母菌和霉菌為指示菌研究活性菌株的抗菌能力。結(jié)果顯示，水菖蒲內(nèi)存在廣泛的具有抗菌活性的內(nèi)生菌，占內(nèi)生菌總數(shù)的40.7%，高活性菌株占內(nèi)生菌總數(shù)的12.39%。其中S9菌株發(fā)酵液具有抗細(xì)菌、酵母菌和絲狀真菌的廣譜抗菌能力，是潛在的食品防腐抗菌資源。

水菖蒲；內(nèi)生菌；抗菌活性

植物內(nèi)生菌是指那些在其生活史的一定階段或全部階段生活在健康植物組織或器官內(nèi)部的并不引起宿主植物出現(xiàn)明顯病害癥狀的真菌[1-2]。由于內(nèi)生菌與宿主植物協(xié)同進(jìn)化，可以產(chǎn)生和宿主相同或相似的生理活性成分[3-4]，因此，從傳統(tǒng)藥用植物及一些特殊環(huán)境植物內(nèi)生菌中篩選活性菌株，已成為微生物領(lǐng)域的研究熱點[5-6]。

水菖蒲(Acorus calamus L.)為天南星科植物，藥用根莖，具有化痰開竅、殺蟲止癢之功效[7]?，F(xiàn)代研究表明水菖蒲具有抗炎、抑菌殺蟲、抗糖尿病等多種藥理活性[8-9]。目前，關(guān)于水菖蒲的研究多集中于化學(xué)成分和藥理作用等方面[8-10]，尚未見對水菖蒲內(nèi)生菌分離及其代謝產(chǎn)物活性方面的報道。本實驗對水菖蒲內(nèi)生菌進(jìn)行分離純化，并對其抗菌活性菌株進(jìn)行篩選，以為水菖蒲內(nèi)生菌資源的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

在鎮(zhèn)江江蘇大學(xué)內(nèi)采摘無可見病斑的健康水菖蒲根莖和葉，原植物由江蘇大學(xué)藥學(xué)院韓邦興博士鑒定，確認(rèn)為水菖蒲(Acorus calamus L.)。

1.2 指示菌

常見食品腐敗菌：銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginos，P.a)ATCC27853、大腸桿菌 (Escherichia coli，E.c)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccus au reus，S.a)、枯草芽孢桿菌 (Bacillus su btilis，B.s)、普通變形桿菌 (Proteus vulgar is，P.v)、產(chǎn)氣桿菌(Bacillus aerogenes，B.a)、納豆芽孢桿菌Bacillus natto，B.n)蠟狀芽孢桿菌 (Bacillus cereu s，B.c)、熱帶假絲酵母(Candida tropicalis，C.t)、釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae，S.c)、黑曲霉(Aspergillus niger，A.n)、康

寧木霉(Trichoderma koningii，T.k)11種指示菌均由江蘇大學(xué)藥學(xué)院制藥工程系保存。

常見農(nóng)業(yè)病原菌：水稻紋枯病菌 (C o r t i c i u m sasakii，C.s)AS3.2872、亞麻刺盤孢(Colletotrichum lini，C.l)AS3.4486、禾谷鐮孢 (Fusarium graminearum，F(xiàn).g)AS3.4598由中國科學(xué)院微生物研究所提供；棉灰星盤多毛孢菌Pestalotia gossypii Hori，P.g)由江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。

常見人體病原真菌：新型隱球菌(Cryptococcus neoformans，C.n)、白色念珠菌(Candida albicans，C.a)由江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院提供。

1.3 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基配方為：馬鈴薯2g/100mL、葡萄糖0.2g/100mL，其中加入0.15g/100mL瓊脂為固體培養(yǎng)基(PDA)；加入150μg/mL青霉素鉀和120μg/mL硫酸鏈霉素為雙抗培養(yǎng)基；真菌培養(yǎng)基、沙堡氏培養(yǎng)基 南京博爾迪生物科技有限公司。

1.4 試劑

二甲基亞砜(DMSO)、吐溫-80、次氯酸鈉溶液(活性氯含量5.2%) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；兩性霉素B(AmB) Sunshine公司；青霉素鉀、硫酸鏈霉素、硫酸阿米卡星(Ak) 華北制藥有限公司；氯化三苯四氮唑(TTC) 上海試劑三廠。

1.5 儀器與設(shè)備

TS100倒置顯微鏡 Nikon公司；SPX-250B生化培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；QYC-211全控溫?fù)u床 上海?，斣囼炘O(shè)備有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺 江蘇蘇凈集團(tuán)有限公司；U410-86超低溫冷凍冰箱 New Brunswick Scientific公司；96孔微量板 Corning公司。

1.6 方法

1.6.1 內(nèi)生菌的分離純化

水菖蒲洗凈晾干后，摘下葉和根莖。在超凈工作臺上進(jìn)行以下操作：75%乙醇浸泡根莖、葉120s后，用不同濃度次氯酸鈉溶液浸泡2～600s，無菌水漂洗4次。去根莖兩頭褐變部分，并剪成0.5cm小段，將葉剪成0.5cm×0.5cm小片。上述材料植入馬鈴薯葡萄糖雙抗固體培養(yǎng)基、10%馬鈴薯葡萄糖雙抗培養(yǎng)基平板中，每皿4～5片(段)，22～28℃倒置培養(yǎng)。待根莖、葉培養(yǎng)基切面處長出菌絲后，挑取其尖端部分移至PDA平板上，28℃培養(yǎng)，反復(fù)純化得水菖蒲內(nèi)生真菌純培養(yǎng)物，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征去除相同菌株。各菌株編號后于4℃冰箱保藏備用。設(shè)置環(huán)境對照、組織印跡對照和漂洗對照確保各環(huán)節(jié)無菌操作。

1.6.2 分類鑒定

根據(jù)內(nèi)生真菌主要的群體形態(tài)特點和個體形態(tài)特點,參考文獻(xiàn)[11]進(jìn)行分類鑒定。

1.6.3 內(nèi)生真菌發(fā)酵液的制備

于250mL三角瓶中加入50mL馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基，滅菌，接入內(nèi)生菌，28℃、120r/min振蕩培養(yǎng)7d。將內(nèi)生菌發(fā)酵液在－70℃和20℃條件下反復(fù)凍融3次，以釋放胞內(nèi)產(chǎn)物，濾去菌絲體，濾液過細(xì)菌過濾器得供試藥液。

1.6.4 指示菌菌懸液制備

各細(xì)菌在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中增菌至108CFU/mL后，用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基稀釋至含菌量為106CFU/mL。

用沙堡氏斜面培養(yǎng)基活化酵母樣真菌，以液體培養(yǎng)基稀釋至菌含量為104CFU/mL。

絲狀真菌在PDA斜面上28℃培養(yǎng)7～10d，產(chǎn)生孢子。加入含有0.1%吐溫-80的沙堡氏液體培養(yǎng)基制備懸液，懸液靜置3～5min，取上層均質(zhì)液體(含孢子以及菌絲片段)至無菌試管，振蕩5s，鏡檢，用沙堡氏液體培養(yǎng)基調(diào)整菌懸液至104CFU/mL。

1.6.5 抗菌活性菌株的篩選

參考NCCLSM38-A和M27實驗方案[12-14]，采用微量稀釋法，以金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌初篩指示菌、大腸桿菌為革蘭氏陰性菌初篩指示菌，對內(nèi)生菌進(jìn)行抗細(xì)菌活性初篩。

1.6.6 高活性菌株的抗菌活性研究

參考NCCLSM38-A和M27實驗方案[12-14]，采用微量稀釋法，測定內(nèi)生菌S9、S15、S24、S70菌株最小抑菌濃度(MIC)、最小殺菌濃度(MBC)。以硫酸阿米卡星為抗細(xì)菌實驗陽性對照或加入兩性霉素B為抗真菌實驗陽性對照，以無菌水為陰性對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 水菖蒲內(nèi)生真菌分離結(jié)果

表1 水菖蒲內(nèi)生真菌的種群、數(shù)量與種類分布Table 1 Genera, quantity and compositions of endophytes isolated fromAcorus calamusL.

根據(jù)菌落培養(yǎng)特征，先后8次共從水菖蒲根莖和葉中分離出內(nèi)生菌113株，經(jīng)微生物形態(tài)觀察，初步鑒定為2綱4目5科15屬(表1)，種類繁多，其中以從?？凭佣啵瑸?8株，占所有菌株的42.5%。根莖、葉中均有分布，葉中的內(nèi)生菌數(shù)量明顯少于根莖中。

2.2 抑菌活性菌株初篩選

經(jīng)反復(fù)篩選，從113株內(nèi)生菌中篩選出了46株對大腸桿菌或金黃色葡萄球菌有抗菌活性的菌株，占所有菌株的40.7%。其中42株對金黃色葡萄球菌有抗菌能力，占所有菌株的37.2%；30株對大腸桿菌有抗菌活性，占所有菌株的26.5%；26株對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都有抑菌活性，占所有菌株的23.0%。有14株表現(xiàn)出了較強的抑菌效果，在發(fā)酵液體積分?jǐn)?shù)為25%時，對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有明顯的抑制效果。其中S9、S15、S24、S70抑菌效果最強(表2)，故對以上4株菌抗菌能力進(jìn)一步研究。

表2 46株對細(xì)菌有抗菌活性的水菖蒲內(nèi)生真菌及抗菌活性Table 2 Antibacterial activities of 46 active endophytic strains

2.3 S9、S15、S24、S70 抑菌活性菌株的能力研究

2.3.1 抑制細(xì)菌活性菌株的能力

表3、4表明，S9、S15、S24、S70都具有不同程度的廣譜抑菌、殺菌能力。其中，S 9抑菌、殺菌能力較強，對大腸桿菌和納豆芽孢桿菌的MIC僅為發(fā)酵原液的0.75%，對其余6種指示菌的MIC也僅為發(fā)酵原液的1.5%。S15、S24、S70的MIC(除部分未測出外)在12.5%發(fā)酵原液到25%發(fā)酵原液之間。S9的MBC也普遍較低，在發(fā)酵原液的1.5%～6.2%之間，對大腸桿菌和納豆芽孢桿菌的殺菌作用尤為突出，僅為1.5%發(fā)酵原液。其他3株菌的殺菌濃度在25%～50%發(fā)酵原液之間，部分未測出，對納豆芽孢桿菌都無殺菌作用。綜合以上實驗結(jié)果，S9具有很好的抑菌、殺菌能力，效果明顯優(yōu)于S15、S24、S70。

表3 抑菌活性菌株對細(xì)菌指示菌的MICTable 3 MICs of active endophytic strains

表4 抑菌活性菌株對細(xì)菌指示菌的MBCTable 4 MBCs of active endophytic strains

2.3.2 抑制酵母樣真菌活性菌株的能力

表 5 抑菌活性菌株對酵母樣真菌指示菌的MICTable 5 MICs of active endophytic strains

如表5所示：S9、S15、S24、S70 4種內(nèi)生菌對4種酵母樣指示菌有不同程度的抑制作用。其中S9和S15

對4種酵母樣真菌有一定的抑制作用，其中對釀酒酵母的抑制作用明顯，MIC分別為6.2%發(fā)酵原液和3.1%發(fā)酵原液。S70對除釀酒酵母以外的3株酵母樣指示菌均有抑制作用，對白色念珠菌的抑制作用明顯，M I C為6.2%發(fā)酵原液。S24對白色念珠菌的最小抑菌濃度為50%發(fā)酵原液，對其余3種酵母樣真菌基本無抑制作用。

2.3.3 抑制絲狀真菌活性菌株的能力

表 6 抑菌活性菌株對絲狀真菌指示菌的MICTable 6 MICs of active endophytic strains to filamentous fungi

如表6所示，S9、S15、S24、S70 4種內(nèi)生菌對6 種農(nóng)業(yè)病原菌有不同程度的抑制作用。S9除對木霉沒有抑制作用外，對其他5種絲狀真菌有明顯的抑制作用，對水稻紋枯病菌的抑制作用最強，MIC為0.75%發(fā)酵原液；S15和S70對3種絲狀真菌有抑制作用，S70對稻瘟霉的抑制作用較強，MIC為6.2%發(fā)酵原液；S24對稻瘟霉的最小抑菌濃度為50%發(fā)酵原液，對其他真菌無明顯抑制作用。

2.4 S9、S15、S24、S70 的形態(tài)學(xué)鑒定

圖1 分離菌株的顯微形態(tài)(×40)Fig.1 Micro-morphology of S9, S15, S24 and S70 strains (×40)

S9菌落灰綠色，邊緣菌絲白色，菌絲不光滑，分隔，大量分生孢子，分生孢子梗，孢子串生。鑒定為木霉屬(Trichoderma sp.)。

S15菌落具有不規(guī)則的放射狀皺紋，絨狀，產(chǎn)生大量的分生孢子，暗褐至黑色，反面呈較暗的黃褐色。分生孢子梗發(fā)生于基質(zhì)；孢梗莖壁平滑；頂囊球形或近球形，分生孢子球形或近球形。鑒定為為曲霉屬(Aspergillus sp.)。

S24菌落白色，菌絲密集，基質(zhì)白色。顯微特征為分生孢子梗分枝，分生孢子聚生成葡萄穗狀，球形、橢圓形或圓筒形，單細(xì)胞，無色，菌核黑色。鑒定為葡萄孢屬(Botrytis sp.)。

S70菌落為白色，菌絲長絨毛狀，可見綠色孢子,菌絲有隔膜，孢子著生在樹枝狀分生孢子梗上。鑒定為青霉屬(Penicillium sp.)。

3 討 論

植物內(nèi)生菌可以工業(yè)化發(fā)酵培養(yǎng)，大規(guī)模生產(chǎn)有效成分，開發(fā)出新的農(nóng)藥、醫(yī)藥和食品防腐劑等。如Strobel研究小組從錫蘭肉桂(Cinnam omumzeylanicum)、心葉船形果木(Eucryphia cordifolia)等植物分離到內(nèi)生菌Muscodor albus和黏帚霉(Gliocladium sp.)，能夠產(chǎn)生抗菌活性較強的揮發(fā)性物質(zhì)，并成功開發(fā)出真菌熏蒸劑[15]。

本實驗選用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作為初篩指示菌，分別代表了G＋、G－菌，對分離得到的113株水菖蒲內(nèi)生菌進(jìn)行了抗菌活性初篩，選用18種常見導(dǎo)致食品腐敗的細(xì)菌、酵母菌和霉菌為指示菌研究活性菌株的抗菌能力。結(jié)果表明，有40.7%的菌株對至少一種指示菌有抗菌活性，12.39%的菌株具有較高的抗菌活性，尤其是S9具有明顯的抗細(xì)菌、酵母菌和絲狀真菌的廣譜抗菌能力，表明水菖蒲中有豐富的內(nèi)生菌資源，其代謝產(chǎn)物有潛在的抗菌物質(zhì)存在。在此基礎(chǔ)上，可以針對性地分離有效活性物質(zhì)，開發(fā)成食品防腐抗菌資源。

[1]CLAY K, HOLAH J. Fungal endophyte symbiosis and plant diversity in successional fields[J]. Science, 1999, 285(5434)∶ 1742-1744.

[2]SAIKKONEN K, WALI P, HELANDERM, et al. Evolution of endophyte pant symbioses[J]. Trends Plant Sci, 2004, 9(8)∶ 275-280.

[3]STROBEL G A, DAISY B. Bioprospecting for microbial endophytes and their natural products[J]. Microbiol Molbiolrev, 2003, 6(7)∶ 491-502.

[4]TAN Renxiang, ZOU Wenxin. Endophytes∶ A rich source of functional metabolites[J]. Nat Prod Rep, 2001, 18(4)∶ 448-459.

[5]赫榮喬. 植物內(nèi)生菌成為我國當(dāng)前微生物研究領(lǐng)域的熱點[J]. 微生物學(xué)通報, 2009, 36(1)∶ 1.

[6]皺文欣, 譚仁祥. 植物內(nèi)生菌研究新進(jìn)展[J]. 植物學(xué)報, 2001, 43(9)∶881-892.

[7]《中華本草》編委會. 中華本草∶ 第八冊[M]. 上?！?上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 1999∶ 468-472.

[8]WU Haoshu, ZHU Difeng, ZHOU Changxin, et al. Insulin sensitizing

activity of ethyl acetate fraction of Acorus calamus L. in vitro and in vivo [J]. Journal of Ethnopharmacology, 2009, 123 (2)∶ 288-292.

[9]KIM H, HAN T H, LEE S G. Anti-inflammatory activity of a water extract of Acorus calamus L. leaves on keratinocyte HaCaT cells[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2009, 122(1)∶ 149-156.

[10]龔先玲, 典靈輝, 張立堅, 等. 水菖蒲根狀莖與根揮發(fā)油化學(xué)成分研究[J]. 中國藥房, 2007, 18(3)∶ 176-178.

[11]魏景超. 真菌鑒定手冊[M]. 上?！?上海科學(xué)技術(shù)出版社, l982.

[12]李厚敏, 劉偉, 李若瑜. 美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會2003年版產(chǎn)孢絲狀真菌藥敏試驗方案簡介[J]. 中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志, 2005, 28(1)∶121.

[13]ESPINEL A, RODRIGUEZ J L, MARTINEZ J V. Comparison of two altenative emicrodilution procedures with the national committee for clinical laboratory standards reference macrodilution method M27-P for in vitro testing off luconazole-resistant and susceptible isolates of Candida albicans[J]. J Clin Microbiol,1995, 33(2)∶ 31-41.

[14]徐叔云, 卞如濂, 陳修. 藥理實驗方法學(xué)[M]. 3版. 北京∶ 人民衛(wèi)生出版社, 2002∶ 1658-1712.

[15]STROBEL G A, EZRA D. The application of volatile antibiotics and non-volatile inhibitors from Muscodor spp. to control harmful microbes in human and animal wastes∶ US, EP20040758618[P]. 2006-04-01.

Screening and Inhibitory Activity of Endophytic Fungi from Acorus calamus L.

ZHOU Xiao-kun1，CHEN Jun1,*，HAN Bang-xing1,2，HE Jia1，LIU Chang-feng1
(1.College of Pharmacy, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China；2. Anhui Engineering Technology Research Center of Plant Cell Engineering, Lu’an 237012, China)

In order to isolate and screen endophytic fungi with inhibitory activity from Acorus calamus L., active strains were screened through modified TTC micro-dilution method. MIC (minimum inhibitory concentration) and MBC (minimum bactericidal concentration) were detected using 18 food spoilage strains. Results indicated that 40.7% endophytes exhibited antimicrobial activity and 12.39% endophytes exhibited higher antimicrobial activity. In addition, strain S9 exhibited the broadspectrum antimicrobial activity to bacteria, yeast and mycelia fungi. Active endophytic strains from A. calamus L. are potential resources for food preservation.

Acorus calamus L.；endophytic fungi；antibacterial activity

Q933

A

1002-6630(2010)09-0211-05

2009-07-09

周曉坤(1984—)，女，碩士研究生，主要從事微生物來源活性物質(zhì)研究。E-mail：zhouxiaokun1984@126.com

*通信作者：陳鈞(1967—)，男，教授，博士，主要從事微生物來源活性物質(zhì)研究。 E-mail：syxchenjun@126.com