李 云，楊勝遠(yuǎn)*，陳郁娜，劉祥流，麥真真，陳 燕

(韓山師范學(xué)院生物系食品與發(fā)酵工程研究所，廣東 潮州 521041)

產(chǎn)谷氨酸脫羧酶片球菌的鑒定及其酶學(xué)性質(zhì)

李 云，楊勝遠(yuǎn)*，陳郁娜，劉祥流，麥真真，陳 燕

(韓山師范學(xué)院生物系食品與發(fā)酵工程研究所，廣東 潮州 521041)

從發(fā)酵蔬菜中分離一株產(chǎn)谷氨酸脫羧酶(glutamate decarboxylase，GAD)的乳酸菌HS2，其菌體細(xì)胞轉(zhuǎn)化Glu 1h，轉(zhuǎn)化液中γ-氨基丁酸含量可達(dá)(3.114±0.133)g/L，通過(guò)形態(tài)培養(yǎng)特征、生理生化特征、16S rDNA序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定菌株HS2是戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)。菌株HS2 GAD最適作用溫度為35℃，最適作用pH4.5。酶的熱穩(wěn)定較好，在pH4.0～6.5于50℃處理4h，酶活基本穩(wěn)定。Ca2+對(duì)酶有激活作用，5mmol/L 和50mmol/L Ca2+濃度使酶活分別提高了37.21%和23.02%。Mg2+和Mn2+在50mmol/L濃度時(shí)激活作用明顯，而Co2+在5mmol/L濃度激活作用較好。

谷氨酸脫羧酶；戊糖片球菌；γ–氨基丁酸；菌種鑒定

谷氨酸脫羧酶(glutamate decarboxylase，GAD)是存在于生物的一種重要的脫羧酶，催化L-谷氨酸(Glu)脫羧生成γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)和CO2[1]。GAD廣泛分布于動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)。在哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)，其脫羧產(chǎn)物GABA是一種主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有重要的生理功能[2]。在植物中，GABA 的合成與植物生長(zhǎng)的逆境生理有重要關(guān)系[3]。細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的GAD酶系統(tǒng)是細(xì)菌對(duì)酸性環(huán)境的應(yīng)激反應(yīng)，維持體內(nèi)pH值穩(wěn)態(tài)的機(jī)制之一[4]。在真核微生物中，GAD在孢子的萌發(fā)過(guò)程中參與能量代謝和起代謝調(diào)控作用[5]。由于GAD在生物體內(nèi)存在的普遍性，對(duì)不同來(lái)源GAD的結(jié)構(gòu)、功能及基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的闡明已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。

微生物來(lái)源的GAD中，乳酸細(xì)菌(lactic acid bacterium，LAB)產(chǎn)GAD受到大量研究者的關(guān)注。乳酸菌在自然界中分布很廣泛，是人和動(dòng)物腸道正常菌群。尋找高GAD活性的食品安全的乳酸菌株，或者采用基因工程技術(shù)獲得高GAD活力的基因工程菌，能夠開(kāi)發(fā)安全高效的生物合成GABA工藝及富含GABA的保健食品。另外，闡明簡(jiǎn)單低等生物GAD結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，能為復(fù)雜高等生物中GAD研究提供重要的線索。文獻(xiàn)已報(bào)道乳球菌屬(L a c t o c o c c u s)[6-7]、鏈球菌屬(Streptococcus)[8]、乳桿菌屬(Lactobacillus)[9-12]等的多種乳酸菌具有GAD活性，研究集中在GAD酶學(xué)性質(zhì)、基

因克隆和表達(dá)等方面，然而尚未見(jiàn)有關(guān)于戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)產(chǎn)GAD方面的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)從自然發(fā)酵的蔬菜中分離和鑒定產(chǎn)GAD的戊糖片球菌，并研究其GAD粗酶的酶學(xué)性質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基、M17培養(yǎng)基、SL培養(yǎng)基、番茄汁培養(yǎng)基和脫脂牛乳培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)[13]進(jìn)行配制。

1.2 試劑與儀器

色譜純?cè)噭?美國(guó)Tedia 和 Honeywell International INC 公司；DNA純化試劑盒 北京天為時(shí)代科技有限公司；γ-氨基丁酸(純度99.0%) Sigma公司；其他試劑為分析純。

PTC-100TMPCR儀 MJ Research公司；Agilent 1100 Series高效液相色譜儀(XDB-C18柱，15cm×4.6mm，5μm) Agilent公司；Sigma2-16離心機(jī) Sigma公司；UY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 PCR引物

采用細(xì)菌1 6 S r D N A的通用引物：2 7 F：5＇-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇，1541R：5＇-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3＇。由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 方法

1.4.1 乳酸菌的分離

取自然發(fā)酵蔬菜(固體樣品預(yù)先破碎，菌較少樣品預(yù)先用適當(dāng)培養(yǎng)基富集)，于無(wú)菌生理鹽水做10倍梯度稀釋。取合適稀釋度的稀釋液1mL分別注入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，以無(wú)菌操作加入已加入1g/100mL CaCO3熔化的MRS瓊脂培養(yǎng)基(預(yù)冷至50℃以下)，培養(yǎng)基倒入平皿后搖勻。待培養(yǎng)基凝固后，倒置于32℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。挑取周?chē)蠧aCO3溶解圈的菌落，于MRS平板上劃線純化。取純化后的菌落，涂布，革蘭氏染色，鏡檢，保留G+的菌株，于脫脂牛乳培養(yǎng)基保藏。

1.4.2 產(chǎn)GAD乳酸菌的篩選

取待篩選的菌株斜面培養(yǎng)18～24h活化后，接種于MRS液體培養(yǎng)基活化18～24h。分別吸取1mL經(jīng)活化的菌液至裝有100mL MRS培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，32℃培養(yǎng)24h，于4℃、8000×g離心15min收集菌體，0.9g/100mL的生理鹽水洗滌，于4℃、8000×g離心15min收集菌體，重復(fù)洗滌3次。按菌體量與谷氨酸鈉1∶10(V/V)的比例，加入1g/100mL L-谷氨酸鈉(溶于0.2mol/L pH4.5乙酸-乙酸鈉緩沖液中)，混勻后，于35℃轉(zhuǎn)化1h，離心取上清液，得轉(zhuǎn)化液。

采用新華一號(hào)層析紙，吸取轉(zhuǎn)化后的上清液1μL進(jìn)行點(diǎn)樣，用10mmol/mL GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液和1g/100mL谷氨酸鈉溶液作對(duì)照，按0.4g/100mL的比例將顯色劑茚三酮加入展開(kāi)劑中，展開(kāi)劑的組成：正丁醇、冰醋酸、水體積比12∶3∶5，展程15～18cm。展開(kāi)后于90℃條件下顯色10min。具有與GABA標(biāo)樣展程一致的斑點(diǎn)的待測(cè)樣品，定性為具有產(chǎn)GAD活性的菌株。參照文獻(xiàn)[14]采用高效液相色譜法對(duì)轉(zhuǎn)化液中的GABA進(jìn)行定量分析。

1.4.3 形態(tài)培養(yǎng)特征及生理生化特征實(shí)驗(yàn)

形態(tài)、培養(yǎng)及基本生理生化特征實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[12,15]。生化特征實(shí)驗(yàn)采用法國(guó)梅里埃vitek 32微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)鑒定。

1.4.416 S rDNA序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析

按文獻(xiàn)[16]方法提取細(xì)菌基因組DNA，采用細(xì)菌16S rDNA的通用引物27F和1541R進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為10mmol/mL MgCl23μL，10×PCR buffer 5μL，dNTP (2.5μmol/L)4μL，TaqTM(5U/μL)0.25μL，上游引物和下游引物(2.5μmol/L)各1μL，模板DNA 1μL，最后加雙蒸水至50μL，混合后瞬間離心，置于PCR儀上95℃變性5min，然后94℃變性30s、52℃退火30s、72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min反應(yīng)結(jié)束。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照記錄結(jié)果。PCR產(chǎn)物通過(guò)電泳，利用北京天為時(shí)代科技有限公司凝膠回收試劑盒割膠回收純化。委托上海生工進(jìn)行生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。將16S rDNA序列與GenBank＋EMBL＋DDBJ＋PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中的核苷酸序列進(jìn)行同源性分析(http∶//www.ncbi.nlm. nih.gov/blast)，利用BioEdit_7.0.0 軟件的Clustal W程序進(jìn)行多重比對(duì)，然后利用Clustal X1.8軟件采用Neighbour-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并進(jìn)行bootstrap分析，重復(fù)次數(shù)為1000次。

1.4.5 GAD制備

將濕菌體3g懸浮到30mL pH5.0的0.2mol/L 乙酸-乙酸鈉緩沖液中，內(nèi)含0.01mmol/L磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate，PLP)，1mmol/L二硫蘇糖醇，冰浴中超聲波破碎(400W，工作5s，間隔15s，全程90min)，4℃放置過(guò)夜，4℃離心(8000×g，20min)收集上清液，作為GAD酶液。

1.4.6 GAD活力測(cè)定

GAD酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系總體積400μL，其中GAD酶液100μL，L-Glu溶液(pH4.5，40mmol/L，含0.02mmol/L PLP)100μL，pH4.5的0.2mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液200μL?；旌虾笥?5℃反應(yīng)4h，加入4倍體積預(yù)冷的冰凍無(wú)水乙醇終止反應(yīng)，然后參照文獻(xiàn)[14]采用高效液相色譜法測(cè)定GABA。在測(cè)定條件下1h生成1μmol

GABA所需酶量定義為1個(gè)酶活力單位(U)。以相對(duì)酶活力比較不同條件處理的GAD活力大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)GAD乳酸菌的分離篩選

從自然發(fā)酵蔬菜中，分離到112株革蘭氏陽(yáng)性、接觸酶陰性的菌株，初步確定為乳酸菌。待測(cè)乳酸菌經(jīng)菌體細(xì)胞轉(zhuǎn)化谷氨酸鈉，轉(zhuǎn)化液紙層析定性檢測(cè)，有9株菌轉(zhuǎn)化液樣與GABA標(biāo)準(zhǔn)有相同的遷移率，說(shuō)明這些菌株具有GAD活力。轉(zhuǎn)化液的GABA含量測(cè)定結(jié)果(圖1)表明，菌株HS2的GAD活力最大，于35℃、0.2mol/L pH4.5乙酸-乙酸鈉緩沖液中轉(zhuǎn)化1h，轉(zhuǎn)化液中GABA的含量達(dá)(3.114±0.133)g/L。

圖1 產(chǎn)GAD菌株轉(zhuǎn)化液的GABA含量Fig.1 The concentration of GABA in transformed liquid with GAD-producing strains

2.2 菌株HS2的鑒定

2.2.1 形態(tài)特征

菌株HS2于35℃ MRS培養(yǎng)基生長(zhǎng)24h，菌落細(xì)小，表面平滑、呈圓形、灰白色、邊緣整齊，培養(yǎng)48h菌落直徑約1～2mm。革蘭氏染色觀察表明菌株HS2為革蘭氏陽(yáng)性、無(wú)芽孢、圓球形、菌體直徑約1μm；細(xì)胞呈對(duì)生，非鏈狀排列，沿兩個(gè)垂直方向分裂形成的四聯(lián)排列(圖2)。

圖 2 菌株HS2菌體形態(tài)(×1000)Fig.2 Morphology of strain HS2 (×1000)

2.2.2 菌株HS2培養(yǎng)及生理生化特征

參照文獻(xiàn)[12,15]進(jìn)行培養(yǎng)及生理生化特征實(shí)驗(yàn)，生理生化特征由vitek 32鑒定系統(tǒng)鑒定，結(jié)果見(jiàn)表1，各項(xiàng)特征符合文獻(xiàn)[12,15]關(guān)于片球菌(Pediococcus)的描述。

表 1 菌株HS2的培養(yǎng)及生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain HS2

2.2.316 S rDNA序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析

以菌株HS2總DNA為模板，利用細(xì)菌16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物大小在1.5kb左右(圖3)。經(jīng)測(cè)序，菌株HS2的16S rDNA序列為1484bp，已在GenBank中登記，登記號(hào)(GenBank accession number)為：GQ465207。將菌株HS2的16S rDNA序列與GenBank＋EMBL＋DDBJ＋PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中報(bào)道的16S rDNA核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)中9株P(guān)ediococcus pentosaceus相似度最高(達(dá)99%)，初步將菌株HS2鑒定為Pediococcus pentosaceus。

圖3 菌株HS2 16SrDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR of 16SrDNA of strain HS2

表 2 菌株HS2的16SrDNA序列與GenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果Table 2 Comparison of 16SrDNA sequence of strain HS2 and the data from GenBank+EMBL+DDBJ+PDB database

以菌株HS2、片球菌屬(Pediococcus)各個(gè)種和部分已報(bào)道產(chǎn)GAD的球菌的16S rDNA核苷酸序列為基礎(chǔ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果顯示，菌株HS2與Pediococcus pentosaceus位于同一簇群，1000次bootstrap分析完全支持該分枝，與片球菌屬其他種的發(fā)育關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)(圖4)。

根據(jù)16S rDNA序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，結(jié)合形態(tài)特征、培養(yǎng)及生理生化特征，對(duì)照文獻(xiàn)[12,15]，鑒定菌株HS2為戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)。2.3菌株HS2 GAD的性質(zhì)

2.3.1 溫度對(duì)菌株HS2酶活力的影響

GAD酶液在不同溫度(25、30、35、40、45、50、60℃)中作用于底物L(fēng)-Glu測(cè)定酶活力，結(jié)果如圖5所示。菌株HS2 GAD酶最適反應(yīng)溫度為35℃，在35～40℃范圍內(nèi)酶活力變化不大，超過(guò)40℃酶活力下降較快，60℃時(shí)相對(duì)酶活力僅35.30%。GAD酶液在不同溫度(4、40、50、60、70℃)保溫4h，再于35℃測(cè)定酶活力，結(jié)果表明在溫度低于50℃以下保溫，酶活力基本保持穩(wěn)定，損失不大，說(shuō)明菌株HS2 GAD的熱穩(wěn)定較好。高于此范圍酶活力快速下降，60℃酶活力損失變大，70℃幾乎完全失去酶活。

2.3.2 pH值對(duì)菌株HS2 GAD酶活力的影響

用不同pH值(3.5～6.5)的緩沖液配制酶反應(yīng)體系，于35℃測(cè)定酶活力，圖6表明該酶的最適反應(yīng)pH值為4.5，pH4.5～5.0較適宜GAD進(jìn)行催化反應(yīng)，酶活力都在90%以上。當(dāng)pH值低于4.5時(shí)酶活力逐漸下降，pH值高于5.0時(shí)酶活力急劇下降。菌株HS2 GAD在pH4.0～6.5間酶活力相對(duì)較穩(wěn)定，經(jīng)不同pH值的緩沖溶液于35℃處理4h，相對(duì)酶活力仍保留90%以上；當(dāng)pH值低于4.0或高于6.5時(shí)，GAD嚴(yán)重失活。

圖 5 溫度對(duì)菌株HS2粗GAD酶活力的影響Fig.5 Effect of temperature on the activity of crude GAD from strain HS2

圖 6 pH值對(duì)菌株HS2粗GAD酶活力的影響Fig.6 Effect of pH on the activity of crude GAD from strain HS2

2.3.3 金屬離子對(duì)菌株HS2 GAD酶活力的影響

在酶反應(yīng)體系中分別加入5mmol/L和50mmol/L不同種類(lèi)的金屬離子，測(cè)定酶活力。

圖 7 金屬離子對(duì)菌株HS2粗GAD酶活力的影響Fig.7 Effects of metal ions on the activity of crude GAD from strain HS2

圖7顯示：當(dāng)金屬離子濃度為5mmol/L時(shí)，Ca2+和Co2+對(duì)菌株HS2 GA D有激活作用，Zn2+、Na+、K+、

Mn2+、Ba2+、Mg2+對(duì)酶活力的影響不大，Cu2+、Pb2+、Hg2+、Fe2+、Fe3+對(duì)酶活力都有抑制作用，其中Hg2+對(duì)GAD酶活性的抑制作用最強(qiáng)，幾乎完全抑制GAD活性；當(dāng)金屬離子濃度為50mmol/L時(shí)，Ca2+、Mg2+、Mn2+對(duì)酶活力有明顯的激活作用，Zn2+和K+對(duì)酶活的影響不大，而B(niǎo)a2+、Co2+、Pb2+、Na+、Cu2+、Hg2+、Fe3+對(duì)GAD酶活力都有不同程度的抑制作用，其中Fe3+、Hg2+幾乎完全抑制GAD活性。由此可知，Ca2+在兩個(gè)濃度均對(duì)酶有激活作用，酶活力分別提高了37.21%和23.02%。Mg2+和Mn2+在較高濃度時(shí)激活作用明顯，而Co2+在較低濃度激活作用較好。結(jié)果表明GAD受金屬離子的影響較大。

3 討 論

已報(bào)道的乳酸菌GAD[6,10-11,17]的最適作用溫度大多在其最適生長(zhǎng)溫度附近，本實(shí)驗(yàn)中的戊糖片球菌HS2的GAD最適溫度也符合其生長(zhǎng)溫度條件。微生物來(lái)源的GAD 最適反應(yīng)pH值在3.8～5.0[18]，已報(bào)道的乳酸菌的GAD[6,10-11,17]最適pH值在4.0～5.0。菌株HS2 GAD最適pH值為4.5，與乳酸菌來(lái)源GAD一致。金屬離子在一定的濃度下，對(duì)酶的活性有激活和抑制作用，特別是重金屬離子容易使酶失活。Ca2+對(duì)有HS2 GAD酶激活作用，Mg2+和Mn2+在較高濃度時(shí)激活作用明顯，而Co2+在較低濃度激活作用較好。與文獻(xiàn)[19]報(bào)道5mmol/L 的Mg2+對(duì)Lactococcus lactis SYFS1.009的GAD具有激活作用較為一致。

片球菌(Pediococcus)在乳酸菌的分類(lèi)地位上，屬于干酪乳桿菌-片球菌群(L.casei-Pediococcus group)，對(duì)動(dòng)植物不致病，常用于蔬菜、奶酪、肉和臘腸等產(chǎn)品的發(fā)酵，是一類(lèi)應(yīng)用于食品工業(yè)安全的微生物。片球菌的代謝產(chǎn)物細(xì)菌素片球菌素(pediocin) 具有天然安全及其耐熱耐酸的特性，作為一種生物防腐劑在食品發(fā)酵和食品保藏中得到廣泛的研究及應(yīng)用[20]。戊糖片球菌(P. pentosaceus)常分離自植物和成熟的干酪，本實(shí)驗(yàn)從發(fā)酵蔬菜中分離到安全的產(chǎn)G A D戊糖片球菌(P. pentosaceus)HS2，對(duì)于利用其GAD催化谷氨酸脫羧生物合成食品級(jí)GABA，以及開(kāi)發(fā)富含GABA的發(fā)酵保健食品，具有較好的應(yīng)用前景。

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Identification and Enzymological Characterization of Glutamate Carboxylase-producing Pediococcus

LI Yun，YANG Sheng-yuan*，CHEN Yu-na，LIU Xiang-liu，MAI Zhen-zhen，CHEN Yan
(Food and Fermentation Engineering Institute of the Department of Biology, Hanshan Normal University, Chaozhou 521041, China)

A glutamate decarboxylase (GAD)-producing lactic acid bacteria (LAB) strain HS2 was isolated from pickled vegetable. When the biotransformation was conducted in cells with strain HS2 for 1 h, the content of γ-aminobutyric acid in biotransformation solution of strain HS2 was (13.114±0.133) g/L. Base on morphological, physiological and biochemical characteristics, 16S rDNA and phylogenic analysis, the strain HS2 was identified as Pediococcus pentosaceus. The optimal temperature and pH for GAD activity were 35 ℃ and 4.5. The GAD from strain HS2 was stable at 50 ℃ for 4 h and resistant to pH in the range of 4.0－6.5. In addition, calcium ions could result in a significant increase of GAD activity, which resulted in an enhancement of GAD activity by 37.21% and 23.02% at the concentrations of 5 mmol/L and 50 mmol/L Ca2+. Similarly, Mg2+and Mn2+also could increase GAD activity at the concentration of 50 mmol/L, whereas Co2+could improve GAD activity at the concentration of 5 mmol/L.

glutamate decarboxylase；Pediococcus pentosaceus；γ–aminobutyric acid；strain identification

Q939.9

A

1002-6630(2010)09-0187-05

2009-09-25

廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(8452104101001546)；國(guó)家星火計(jì)劃項(xiàng)目(2008GA780032)；韓山師范學(xué)院科研基金資助項(xiàng)目

李云(1977—)，男，講師，碩士，研究方向?yàn)閼?yīng)用微生物學(xué)和發(fā)酵工程。E-mail：fgtmyself@yahoo.com.cn

*通信作者：楊勝遠(yuǎn)(1972—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸飳W(xué)及生物技術(shù)。E-mail：yshengyuan2004@yahoo.com.cn