奉俊敏,郭 偉,李少明

(廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,廣東 廣州 510120)

腦梗死缺血性損傷機制錯綜復(fù)雜,其中炎性損傷機制研究備受矚目,各種炎性細胞的激活,細胞因子、炎性遞質(zhì)的釋放,共同造成或加重缺血性損傷,而炎性受體的表達及激活是關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。Toll樣受體 4(Toll-like Receptor4,TLR4)作為跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體,最初被認為介導(dǎo)細菌內(nèi)毒素(LPS)誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng),但隨著研究的深入,發(fā)現(xiàn) TLR4參與腦缺血再灌注炎性損傷[1-2]。試驗證實腦梗死急性期TLR4表達上調(diào),血清炎性因子顯著升高[3],但兩者在腦梗死病程中的動態(tài)相關(guān)性研究,國內(nèi)外少見文獻報道。本文運用 RT-PCR法、ELISA法測定腦梗死發(fā)病第 1天、第 2天、第 7天外周血單個核細胞(淋巴細胞、單核細胞)TLR4 mRNA表達及血清 TNF-α濃度,進一步探討 TLR4在急性腦梗死缺血炎性損傷中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象 于 2009年 1月至 2009年 9月,收集在發(fā)病第 1天內(nèi)收住廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科的急性腦梗死患者 35例,動態(tài)觀察 7 d,對其進行發(fā)病第 1天、第 2天、第 7天三個時間點的外周血淋巴細胞、單核細胞 TLR4 mRNA表達與血清 TNF-α水平動態(tài)測定。所有病例均符合 1995年全國第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會議制定的診斷標準,并且入院 3 d內(nèi)經(jīng) MRI證實。有下列情況之一者排除:(1)發(fā)病前兩周有炎性病變史或住院時發(fā)生感染性疾病者;(2)急性心肌梗死者;(3)急性肝缺血病變者;(4)自身免疫性疾病者;(5)使用激素或免疫抑制劑者;(6)不依從或不能完成本課題涉及指標測定者。收集同期性別年齡匹配的廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院老年科體檢健康者 20例作正常對照組;收集同期性別年齡匹配的來廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院就診的腦動脈粥樣硬化患者和(或)冠狀動脈粥樣硬化患者 20例作動脈粥樣硬化組。

1.2 試劑與儀器 Trizol(intrivogen公司),M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶(200 U/μl)、Olig(dT)18、RNA酶抑制劑 (20 U/μl)、10 Mm dNTPMix、5×反應(yīng) Buffer(MBI公司 ),DNaseⅠ 、Taq DNA Polymerase、PCR Mark(大連寶生物工程有限公司),DEPC(Sigma公司),引物(上海博亞生物公司),人 TNF-αELISA試劑盒(北京晶美試劑公司),其他試劑均為國產(chǎn)分析純。PCR熱循環(huán)儀(Techne公司),全自動紫外分光光度儀(Perkin Elmer公司),電泳凝膠圖像分析儀(Tanon公司),高速低溫離心機(Universal公司)。

1.3 標本處理 取禁食 12 h以上清晨空腹肘靜脈血 8 ml,6 ml靜脈血肝素(50 U/ml靜脈血)抗凝,搖勻,選用 Ficoll分層液法分離得到單個核細胞,2 ml靜脈血不抗凝,室溫下凝固后分離血清,-20°C下冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 RT-PCR 總 RNA按照 intrivogen公司試劑盒說明書進行抽提與純化,并經(jīng) DNaseⅠ處理。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照 MRI公司試劑盒說明書進行。TLR4引物設(shè)計參照 Helen等[4]文獻,上游引物為:5′TGGATACGTTTCCTTATAAG 3′;下游引物為 :5′GAAATGGAGGCACCCCTTC 3′。 TLR4的 PCR擴增片斷為 507 bp。內(nèi)參為 β-actin,內(nèi)參引物由上海博亞生物公司設(shè)計,上游引物為:5′GGGACCTGACTGACTACCTCAT 3′;下游引物為 :5′CAAGAAAGGGTGTAACGCAAC 3′。 β-actin的 PCR擴增片斷為610 bp。TLR4與內(nèi)參 β-actin同管擴增,PCR反應(yīng)條件為:預(yù)變性 :94°C 5 min;循環(huán) 28次:95°C 45 s,54°C 45 s,72°C 60 s;終末延伸 :72°C 10 min。

1.5 瓊脂糖凝膠電泳及半定量 取 PCR產(chǎn)物5μl,加 6×載樣緩沖液 1μl,在含有 0.5μg/ml EB的 1.2%瓊脂糖凝膠中電泳 55 min,恒壓 110 V。凝膠圖像分析系統(tǒng)測量出 TLR4、β-actin的平均光密度值,兩者的比值作為衡量 TLR4 mRNA表達高低的相對值。

1.6 血清 TNF-α濃度測定 采用雙抗體夾心 ABC-ELISA法,按照晶美公司人 TNF-αELISA試劑盒說明書進行檢測。

1.7 腦梗死患者梗死體積計算 35例腦梗死患者均在發(fā)病 3 d內(nèi)行頭部 MRI檢查,根據(jù) MRI(DWI序列)結(jié)果,采用多田公式計算腦梗死體積(腦梗死體積 =π/6×長 ×寬 ×MRI陽性掃描層數(shù)×層厚),由兩名放射科醫(yī)生分別進行,取其平均值。

1.8 腦梗死體積分組 依據(jù)發(fā)病第 3天腦梗死體積大小將 35例腦梗死患者分為三組[5],≤4 cm3為小梗死組,＞4 cm3、＜10 cm3為中梗死組,≥10 cm3為大梗死組。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗測定的計量資料數(shù)值用均數(shù) ±標準差(x±s)表示。多個獨立樣本均數(shù)間的兩兩比較用 one-way ANOVA及基于此的 q檢驗,TLR4 mRNA與 TNF-α的相關(guān)性用 pearson相關(guān)分析。以 P值 ＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。所有數(shù)據(jù)使用 SPSS11.5軟件包進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié) 果

2.1 腦梗死組(第 3天)、動脈粥樣硬化組、正常對照組中的外周血單個核細胞 TLR4 mRNA表達及血清 TNF-α濃度比較見表 1。

TLR4 mRNA、血清 TNF-α在腦梗死組的水平明顯高于動脈粥樣硬化組和正常對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

表1 腦梗死組(第 3天)、動脈粥樣硬化組、正常對照組中的TLR4 mRNA表達水平及血清 TNF-α濃度比較(x±s)

2.2 腦梗死組(第 3天)外周血單個核細胞TLR4 mRNA表達與血清濃度 TNF-α呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為 0.846(P＜0.01)。

2.3 不同腦梗死體積組的外周血單個核細胞TLR4 mRNA表達及血清 TNF-α濃度差異比較見表2。

腦梗死三組之間,TLR4 mRNA表達水平及血清TNF-α濃度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01),腦梗死體積越大,TLR4 mRNA表達及血清 TNF-α濃度越高。

表2 不同腦梗死組中的 TLR4 mRNA表達及血清TNF-α濃度比較(x±s)

2.4 腦梗死患者 TLR4 mRNA表達與血清 TNF-α水平動態(tài)變化。在發(fā)病 24 h內(nèi)入院并連續(xù)完成三個時間點觀察的急性腦梗死患者 35例,對其進行周圍血淋巴細胞和單核細胞的 TLR4 mRNA表達與血清 TNF-α濃度動態(tài)變化觀察,時間點依次為第 1天、第 3天、第 7天,結(jié)果表明:

(1)腦梗死患者的 TLR4 mRNA動態(tài)表達大致呈上升趨勢 (見表 3、圖 1、圖 3)。第 1天的 TLR4 mRNA表達與第 3天、第 7天的 TLR4 mRNA表達水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義,第 3天的 TLR4 mRNA表達水平與第 7天的 TLR4 mRNA表達相近,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。發(fā)病第 1天 TLR4 mRNA與正常對照組相比,即有明顯升高趨勢(上升 1.71倍),第 3天大幅度上調(diào)至高表達水平,第 7天與第 3天的表達水平大致呈平臺期。

(2)腦梗死患者的血清 TNF-α動態(tài)濃度亦呈上升趨勢(見表 4、圖 2)。第 1天的血清 TNF-α濃度與第 3天、第 7天的血清 TNF-α濃度比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,第 3天的血清 TNF-α濃度與第 7天的血清 TNF-α濃度比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。血清 TNF-α濃度在發(fā)病第 1天比正常組略有升高(上升 0.81倍),第 3天呈大幅度升高趨勢,第 7天的血清 TNF-α濃度最高。

表3 腦梗死組患者第 1天、第 3天、第 7天的動態(tài) TLR4 mRNA表達及與正常對照組、動脈粥樣硬化組比較(x±s)

表4 腦梗死組患者第 1天、第 3天、第 7天的動態(tài) TNF-α水平及與正常對照組、動脈粥樣硬化組比較(x±s)

圖1 腦梗死患者的第 1天、第 3天、第 7天動態(tài)TLR4 mRNA表達變化及與正常對照組、動脈粥樣硬化組的比較

圖2 腦梗死患者的第 1天、第 3天、第 7天動態(tài)血清 TNF-α濃度變化及與正常對照組、動脈粥樣硬化組的比較

圖3 發(fā)病第 1天、第 3天、第 7天不同時間點與正常對照組、動脈粥樣硬化組的 PCR產(chǎn)物1:正常對照組2:動脈粥樣硬化組3:發(fā)病第 1天患者 507bp處為 TLR 4擴增產(chǎn)物4:發(fā)病第 3天患者 610bp處為 β-actin擴增產(chǎn)物5:發(fā)病第 7天患者

3 討 論

腦梗死后壞死及缺血區(qū)域因急性缺血而觸發(fā)炎性瀑布反應(yīng),導(dǎo)致過度的炎性損傷,成為神經(jīng)元死亡的重要機制之一。TNF-α是腦缺血炎性損傷機制中的重要效應(yīng)因子。本試驗對急性腦梗死病程的動態(tài)觀察研究表明:TNF-α在腦梗死急性期(7 d內(nèi))呈上升趨勢,第 7天最高;而且,梗死面積越大,血清TNF-α濃度越高;腦梗死體積與血清 TNF-α呈正相關(guān)。提示 TNF-α在缺血病理損傷機制中發(fā)揮著強大的致炎作用。但 TNF-α僅是炎性損傷機制鏈條末端的效應(yīng)環(huán)節(jié),它的上游啟動環(huán)節(jié)及促使它被產(chǎn)生、分泌的始發(fā)因素值得進一步去探索。

Toll樣受體(TLRs)是一個介導(dǎo)天然免疫的古老家族,是歷經(jīng)數(shù)億年演化而仍然保存的宿主防御機制之一。自 1998年 Poltorak等[6]發(fā)現(xiàn)了 TLR4以來,其作為炎性跨膜受體在感染性疾病研究領(lǐng)域中已是熱點。然而,近年來 TLR4基因敲除鼠的缺血模型實驗[7-9]表明:TLR4參與心肌、肝臟缺血炎性損傷機制,并與炎性因子的產(chǎn)生緊密相關(guān)。本試驗結(jié)果表明 TLR4 mRNA在腦梗死組中的表達上調(diào),TLR4 mRNA在腦梗死患者組的表達水平明顯高于動脈粥樣硬化組和正常對照組,腦梗死體積越大,TLR4 mRNA表達越高。腦梗死體積與周圍淋巴、單核細胞 TLR4 mRNA表達呈正相關(guān)。

TLR4在外周血淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞膜上表達豐富。中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達 TLR4的主要細胞是小膠質(zhì)細胞[10],它在炎性狀態(tài)下被激活后發(fā)揮強有力的致炎作用,TLR4是小膠質(zhì)細胞執(zhí)行免疫功能作用的關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體之一[11]。同時在腦血管內(nèi)皮細胞、軟腦膜、脈絡(luò)叢、穹隆下器、終板的血管性器官及正中隆起、最后區(qū)等處也發(fā)現(xiàn)表達[12]。而腦缺血病理損傷中小膠質(zhì)細胞、巨噬細胞、淋巴細胞、單核細胞是 TNF-α產(chǎn)生分泌的主要來源之一[13]。腦梗死時,缺血缺氧所促發(fā)的血管內(nèi)皮通透性改變,腦組織壞死物質(zhì)的釋放,吸引外源性的單核/巨噬細胞、淋巴細胞趨化、聚集,成為加劇炎性損傷的效應(yīng)細胞,這些細胞均有豐富的TLR4表達?；谏鲜稣J識,可以認為 TLR4 mRNA表達和 TNF-α產(chǎn)生、分泌均源于相同的細胞,有共同的物質(zhì)基礎(chǔ)。

本實驗對 35例 24 h入院的急性腦梗死患者外周血淋巴細胞、單核細胞的 TLR4 mRNA表達及血清TNF-α濃度進行第 1天、第 3天、第 7天的動態(tài)觀察,兩者在急性期均呈上升趨勢,而 TLR4 mRNA的表達在發(fā)病的第 1天即明顯升高,血清 TNF-α濃度僅略比正常組高;第 3天 TLR4 mRNA表達達到較高水平時,TNF-a的濃度才呈大幅度的上升趨勢;第 7天 TLR4 mRNA持續(xù)在高水平的平臺期時,TNF-α仍在繼續(xù)升高,并且達到 7 d內(nèi)的最高值。盡管我們僅對腦梗死急性期 7 d內(nèi)的有限三個時間點做了粗略動態(tài)觀察,不能推測第 7天后 TLR4 mRNA表達和 TNF-α濃度的升降,但該結(jié)果仍然體現(xiàn)了兩者上升的大致變化輪廓。急性腦梗死患者外周淋巴細胞、單核細胞的 TLR4 mRNA表達變化規(guī)律目前在國內(nèi)外少見報道。第 3天的 TLR4 mRNA表達與TNF-α濃度相關(guān)性研究顯示:兩者呈正相關(guān),具有統(tǒng)計學(xué)意義。上述結(jié)果提示 TNF-α的產(chǎn)生、分泌可能與 TLR4 mRNA表達存在著密切聯(lián)系。已有研究[14]證實內(nèi)毒素血癥模型的 TLR4基因缺陷鼠心肌中 TNF-αmRNA表達缺如,而正常鼠心肌中 TNF-αmRNA表達迅速增高,兩者的表達差異,揭示了TLR4與炎癥因子 TNF-α之間的因果關(guān)系。TLR4作為重要炎性受體,介導(dǎo)炎性損傷,其機制[15]可能為啟動胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo),通過 NF-κB(核因子 -κB)和 JNK(c-Jun氨基末端激酶)/SAPK(應(yīng)急激活蛋白激酶)兩條途徑,激活炎性細胞,導(dǎo)致炎性因子:IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、NO、PAF、PGs和粘附分子等的大量表達,觸發(fā)一系列炎性反應(yīng)。而上述炎性因子也正是腦缺血炎性損傷中的效應(yīng)分子。由本試驗中 TLR4 mRNA表達和 TNF-α濃度的動態(tài)變化趨勢可知:第 3天 TLR4 mRNA表達已達較高水平,TNF-α濃度第 7天才達最高,時間上滯后于TLR4 mRNA。由此推測:在腦缺血損傷炎性病機制中,TLR4 mRNA表達增加有可能是 TNF-α產(chǎn)生、分泌增多的上游啟動環(huán)節(jié),從而參與介導(dǎo)腦缺血炎性損傷。

當(dāng)然,TLR4促使 TNF-α產(chǎn)生、分泌僅是 TLR4強大炎性機制中的一部分,TLR4的表達及功能狀態(tài)與炎性損傷程度存在緊密聯(lián)系。如果在合適的時間窗內(nèi)能從 TLR4的水平阻斷其下游炎性瀑布效應(yīng),將會有效遏制腦缺血炎性損傷。TLR4既是人體的天然免疫防御機制,又參與過度炎性損傷。探索TLR4在急性腦梗死缺血炎性損傷中的作用機制,將為臨床提供治療靶點。

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