陳彥杰

Polo-Like激酶1(Plk1)是參與有絲分裂調控的重要因子，與細胞增殖密切相關。人體許多惡性腫瘤中Plk1都存在過度表達，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。野生型P53是最常發(fā)生突變的抑癌基因，而Plk1被認為是腫瘤抑制因子P53的負向調節(jié)器，Plk1分子的過剩以及P53分子的短缺將導致腫瘤形成。細胞增殖抑制基因P21WAF1/CIP1(P21)是P53基因蛋白的下游調控因子，P53基因突變會誘導P21蛋白產生減少，使細胞周期調節(jié)紊亂，而導致細胞增殖失控，引起腫瘤發(fā)生。近年來一系列的體外細胞分子實驗研究表明三者在細胞增殖發(fā)生癌變過程中密切相關，但在體內腫瘤蛋白質水平上的研究并不多，尤其在結直腸癌的發(fā)生中，對于Plk1與P53之間相互關系的研究國內只有1例報道，P53和P21的相關性研究結論并不一致，而三者之間的相關關系的研究筆者尚未見國內外報道。本研究采用免疫組化方法檢測三者在結直腸癌中的表達，在蛋白質水平探討它們在結直腸癌發(fā)生中的相關關系。由于組織中野生型P53的表達水平很低，半衰期很短，常規(guī)免疫組化方法無法測出。野生型P53發(fā)生突變后，原有功能消失，新產生的突變型P53半衰期明顯延長，通過常規(guī)免疫組化方法即可以測出。因此如果在腫瘤組織中通過免疫組化方法測出P53的表達，是突變型P53，P53蛋白陽性表達表示細胞中的P53蛋白具有促癌作用或失去抑癌作用。

1 材料與方法

1．1 標本來源 收集我院2008年3月至2010年5月結直腸腺癌標本60例，其中男28例，女32例;年齡19～78歲，平均年齡58歲;發(fā)生部位:結腸癌25例，直腸癌35例;組織分化程度高分化腺癌24例，中分化腺癌20例，低分化腺癌16例。所有患者均為散發(fā)病例，且為初次手術，術前未作任何抗腫瘤治療。另選20例正常結直腸黏膜作為對照。

1．2 方法 采用MaxVision TM即用型快速免疫組化一步法。鼠抗人Plk1單克隆抗體原液、抗體稀釋液購自美國Santa Cruz公司，稀釋度為1∶80;即用型鼠抗人 P53、P21WAF1/CIP1和MaxVisionTM即用型試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術有限公司。所有標本均用13%甲醛固定，石蠟包埋，3μm連續(xù)切片，玻片經APES防脫處理，常規(guī)脫蠟和水化。染色前經高溫高壓抗原修復法預處理，抗原修復液和洗液均采用pH值7．4 PBS緩沖液。一抗室溫孵育1．5 h，二抗室溫孵育20 min，DAB顯色，蘇木素復染。用已知陽性結腸癌標本做陽性對照，用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照。

1．3 判定標準 Plk1蛋白表達主要定位與細胞漿，間質有弱表達;P53和P21蛋白陽性則定位于細胞核。每張切片選5個具有代表性的高倍視野，每個視野計數(shù)100個細胞，觀察免疫組織化學的染色情況。采用IHS評分，評分方法如下:(1)陽性細胞染色強弱(記為a):未著色為0分，淡黃色1分，黃色為2分，棕黃色為3分。(2)陽性細胞百分比(記為b):＜5%為0分，6% ～25%為1分，26% ～50%為2分，51% ～80%為3分，81% ～100%為4分。(3)a與b乘積為IHS評分進行半定量分析:0～1為陰性－，2～4分為弱陽性+，5～8分為中度陽性++，9～12分為強陽性+++。陽性定義2～12分，陰性定義0～1分。

1．4 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 18．0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2．1 Plk1、P53、P21WAF1/CIP1蛋白的表達情況 Plk1在20例正常黏膜中，陽性表達3例，陽性率15%，且為弱表達(+);在60例腺癌中，陽性表達47例，陽性率78．3%，著色程度弱陽性5例，中度陽性20例，強陽性35例。P53在20例正常黏膜中陽性1例，陽性率5%;60例腺癌中陽性表達44例，陽性率73．3%，著色程度弱陽性8例，中度陽性17例，強陽性19例。P21在20例正常黏膜中，陽性表達18例，陽性率90%，弱陽性4例，中度陽性5例，強陽性10例;在60例腺癌中陽性表達19例，陽性率31．7%，弱陽性7例，中度陽性8例，強陽性4例。見圖1～9。3組與對照組表達差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0．01)。

2．2 Plk1、P53、P21與臨床病例特征的關系 本研究組三種蛋白與病例的性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、分化程度、淋巴結轉移、Dukes’分期均未發(fā)現(xiàn)有相關性(P ＞0．05)。

2．3 Plk1、P53、P21蛋白表達的相關關系 結直腸腺癌中Plk1與P53二者呈正相關關系(r=0．567，P ＜0．05);P53與P21呈負相關關系(r= －0．643，P ＜0．05);Plk1與 P21比較，呈負(r= －0．599，P ＜0．05);Plk1、P53聯(lián)合表達與 P21 呈負相關關系(r= －0．656，P ＜0．05)。見表 1。

表1 Plk1、P53、P21蛋白在結直腸癌中表達的相關關系分析 例

2．4 Plk1、P53聯(lián)合表達與P21呈負相關關系在腫瘤分化程度的相關性 5例同陽病例3例出現(xiàn)在低分化腺癌組，占60%，1例出現(xiàn)在中分化腺癌組，占20%，1例出現(xiàn)在高分化腺癌組，占20%。低分化腺癌組與中、高分化腺癌組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)。但其他表達方式未發(fā)現(xiàn)有分布差異。

圖1 Plk1在正常黏膜中的陰性表達(SP×400)

圖2 P53在正常黏膜中的陰性表達(SP×400)

圖3 P21在正常黏膜中的陽性表達(SP×400)

圖4 Plk1在結腸中分化腺癌中的陰性表達(SP×400)

圖5 P53在結腸中分化腺癌中的陰性表達

圖6 P21在結腸中分化腺癌中的陽性表達(SP×400)

圖7 Plk1在直腸高分化腺癌中的陽性表達

圖8 P53在直腸高分化腺癌中的陽性表達(SP×400)

圖9 P21在直腸高分化腺癌中的陰性表達(SP×400)

3 討論

細胞周期與腫瘤的關系是近年來生命科學研究中的熱門課題之一，腫瘤是一類細胞周期性疾病。Plk1是Plk家族中的一員，在細胞的有絲分裂中起廣泛調節(jié)作用，具有調控細胞周期、抑制細胞凋亡等作用。PLK1的主要功能表現(xiàn)在細胞周期G2/M交界點轉換過程中通過磷酸化下游底物而實現(xiàn)其功能，阻斷plk1表達可導致體外腫瘤細胞分裂停滯及凋亡，Plk1的過表達能促進腫瘤的惡轉化在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。P53是最常發(fā)生突變的抑癌基因，Yang等［1］關于P53致癌機制的研究發(fā)現(xiàn)P53是Plk1的作用靶點之一，Plk1分子通過調節(jié)Topors磷酸化機制從而抑制了P53的功能，Plk1的過表達可以導致P53的突變，抑制P53的抑癌作用，Plk1分子的過剩以及P53分子的短缺將導致腫瘤形成。對于P53-依賴的轉錄激活作用的靶點是細胞周期蛋白-依賴上激酶抑制因子P21WAF1/CIP1是細胞周期負調控因子，具有阻滯細胞通過G1/S期的作用，從而抑制細胞增殖，P53是通過P21發(fā)揮它的功能。所以也可猜測Plk1是P21的負向調節(jié)器［2］。在一項P53缺失的肺癌細胞H1299的研究中他們發(fā)現(xiàn)外源性Plk1和P53的表達可以明顯降低P21的轉錄，熒光分析也表明Plk1能阻斷P53依賴的內源性的P21的誘導作用［2］?？梢娙咴诩毎鲋嘲l(fā)生癌變過程中密切相關。

關于Plk1、P53、P21三者相關關系的研究，大多是體外細胞實驗，在體內腫瘤蛋白質水平上的研究尤其在結直腸癌中的研究并不多見，研究結果也不統(tǒng)一。在本研究中Plk1與P53的過表達、Plk1與P53之間正相關關系與文獻［3］結果基本一致。本研究還發(fā)現(xiàn)Plk1與P21呈負相關相關系，在中高分化腺癌組Plk1、P53聯(lián)合表達與P21表達呈負相關關系，在低分化腺癌組同陽表達病例的高比率可能提示三者作用于低分化腺癌的發(fā)生過程中有其他作用因子參與，也可能與選取病例有關，進一步的證明尚需更多研究。本研究證明了Plk1、P53、P21在結直腸癌發(fā)生中關系密切，這一結論為三者在結直腸癌發(fā)生過程中的相關作用靶點關系提供了組織學依據(jù)，同時展望在結直腸腺癌的治療中可以采取從Plk1、P53、P21三個治療靶點聯(lián)合治療的方法，為更有效的分子靶向治療癌癥研究提供依據(jù)。

1 Yang X，Li H，Zhou Z，et al．Plk1-mediated phosphorylation of Topors regulates p53 stability．JBiol Chem，2009，10:18588-18592．

2 董憲喆，張鵬，畢明剛．絲/蘇氨酸激酶PLK1研究進展．中國藥理通報，2010，26:289-293．

3 Manguila Flavien，許文懷，王智勇．大腸癌中P53和P21WAF1/CIP1蛋白表達及其意義．北京大學學報，2001，33:582．