劉 輝,吳衛(wèi)平,朱效華,冶保獻

1)鄭州師范學(xué)院化學(xué)系鄭州 450044 2)商丘師范學(xué)院化學(xué)系商丘 476000 3)鄭州大學(xué)化學(xué)系鄭州 450001

#通訊作者,男,1958年7月生,博士,教授,研究方向:生物電化學(xué)及電分析化學(xué)

槐定堿(sophoridine,SR)屬苦參堿類生物堿,廣泛分布于苦參和苦豆子等中草藥中,屬四環(huán)喹諾里西啶類(quinuolizindine),其分子骨架可看作2個喹諾環(huán)的稠和體。槐定堿具有抗腫瘤、抗心律失常、抑制免疫功能和抑菌消炎等作用,臨床上用于癌癥、心律失常和肝炎等疾病的治療[1],對惡性滋養(yǎng)細胞腫瘤亦有顯著療效,同時對惡性淋巴瘤和消化道腫瘤也有一定療效,且毒性較低[2]。近年來,有關(guān) SR的研究方法主要集中在測定[3-6]方面。而利用電化學(xué)手段系統(tǒng)研究SR的電極反應(yīng)機制未見報道。作者研究了SR在玻碳電極上的電化學(xué)行為及其電極反應(yīng)機制,有助于了解其在體內(nèi)的氧化還原代謝機制,以進一步闡明其在體內(nèi)的代謝狀況和過程;同時,建立了差示脈沖伏安法測定 SR含量的新方法,為生物醫(yī)藥研究提供一定的理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑 儀器:CHI-620A電化學(xué)系統(tǒng)(上海辰華儀器公司);三電極體系,玻碳電極為工作電極(GCE,d=3mm),飽和甘汞電極(SCE)為參比電極(文中所指電位均為相對于SCE的電位),鉑絲為對電極;TU-1901紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)。試劑:SR(中國藥品生物制品檢定所),硼酸-氯化鉀-碳酸鈉(A-P)緩沖溶液,其他試劑均為分析純或優(yōu)級純,實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 SR循環(huán)伏安行為及電極動力學(xué)參數(shù)測定 所有實驗均無需除氧且在室溫下進行。將玻碳電極先在金相砂紙上拋光,再依次用 1.00、0.30和 0.05 μm的Al2O3漿在麂皮上拋光至鏡面,每次拋光后用蒸餾水沖洗,然后在超聲波中用新鮮的二次蒸餾水清洗。取10m L A-P緩沖溶液(pH 7.4)于電解池中,加入100μL的SR標準溶液,于0～1.2 V電位范圍內(nèi)進行循環(huán)伏安掃描,記錄其峰電流-峰電位曲線及相關(guān)數(shù)據(jù),進行 SR的電極行為研究及電極動力學(xué)參數(shù)(α、n、ks、Do和反應(yīng)質(zhì)子數(shù))的求算。

1.3 干擾實驗 在1.2實驗方法下,分別觀察實際樣品中ZnSO4、CaCl2、MgSO4、KH2PO4、NaAc、K2HPO4、檸檬酸、抗壞血酸和維生素 B1等干擾物對分析方法的影響。

1.4 SR峰電流-濃度曲線繪制 選用測定靈敏度高、分辨率好的差示脈沖伏安法來確定分析條件。在50 mV脈沖高度,脈沖寬度為0.05 s的最優(yōu)條件下,分別記錄加入 8×10-7、1×10-6、2×10-6、5× 10-6、1×10-5、1.5×10-5、2×10-5、3×10-5和3.5× 10-5mol/L的SR標準溶液差示脈沖伏安曲線,繪制SR峰電流-濃度曲線。

1.5 混合尿樣中SR含量的測定 用10m L的A-P緩沖溶液(pH 7.4)稀釋20μL的尿樣混合液,不經(jīng)過任何前處理轉(zhuǎn)移到電解池。在 1.4實驗方法下,進行差示脈沖伏安掃描,記錄差示脈沖曲線,進行混合尿樣中SR含量的測定。

2 結(jié)果

2.1 峰電流與SR濃度關(guān)系 結(jié)果見圖1?？芍?峰電流隨SR濃度增加而增加,并在 8.0×10-6～3.0× 10-4mol/L濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系,檢出限為2.0× 10-6mol/L,其線性回歸方程和確定系數(shù)分別為:

對5.0×10-5mol/L的SR重復(fù)測定10次,相對標準偏差為3.0%。

圖1 SR峰電流-濃度曲線圖

2.2.1 SR的循環(huán)伏安行為 SR在0～1.2 V電位窗口的循環(huán)伏安掃描曲線見圖 2。圖中曲線 a為空白底液的掃描曲線;曲線b為在空白底液中加入SR (5.0×10-4mol/L)后的循環(huán)伏安曲線,在0.875 V處出現(xiàn) 1個氧化峰。反掃時無還原峰。

圖2 SR的循環(huán)伏安圖a:A-P(pH 7.4)緩沖溶液;b:A-P(pH 7.4)緩沖溶液+SR (5.0×10-4 mol/L),掃描速度100m V/s。

2.2.2 α、n及ks的確定 根據(jù)Nicholson[7]公式,對于不可逆陽極反應(yīng),峰電位(Ep)與lnv間的關(guān)系可表述為:

其中,Eθ為標準電動勢,α為電荷轉(zhuǎn)移系數(shù),nα為SR氧化過程中電子轉(zhuǎn)移數(shù),Do為SR擴散系數(shù), F為法拉第常數(shù)(96 485 C/mol),ks為表觀電子傳遞速率常數(shù)。在 20～400 mV/s掃描范圍內(nèi),以 Ep對lnυ作圖得一直線(圖3),根據(jù)直線斜率,可求出αnα=0.87,假設(shè)α=0.5,則nα=n=1.75≈2,于是α即為 0.44。同時根據(jù)恒電位電解法,由法拉第定律也計算出其 nα為 2,證明上述假設(shè)成立。

另外,從Ep-lnv直線縱坐標上外推到v=0時,可求得Eθ,根據(jù)直線的截距可以計算出 ks的值為7.12×10-3s-1。

圖3 Ep-lnv曲線圖

2.2.3 Do的測定 根據(jù)峰電流與掃速呈一次線性關(guān)系,初步說明 SR在玻碳電極上反應(yīng)過程為擴散控制過程,由Controll方程[8]:

其中Q為電量。繪制Q-t1/2關(guān)系曲線(圖4),從曲線斜率求得SR的Do為2.16×10-5cm2/s。

圖4 Q-t1/2曲線圖

2.2.4 參與電極反應(yīng)的質(zhì)子數(shù) 可由溶液pH值改變對Ep的影響來求得。根據(jù)能斯特方程:

繪制Ep-pH關(guān)系曲線(圖5)。由直線斜率求得m值,從而求得參加電極反應(yīng)的質(zhì)子數(shù)。從 Ep-pH直線的斜率求得m=2,從而得知參與電極反應(yīng)的質(zhì)子是 2,說明有 2個[H+]參與了電極反應(yīng)。

圖5 Ep-pH曲線圖

2.3 干擾實驗 結(jié)果表明,100倍ZnSO4、CaCl2、Mg-SO4和KH2PO4,50倍的NaAc、K2HPO4和檸檬酸,10倍的抗壞血酸對實驗不干擾;只有高濃度維生素 B1(1.5×10-4mol/L)存在的情況下,干擾測定。

2.4 混合尿樣中SR的測定 結(jié)果見表1。

表1 混合尿樣中SR測定結(jié)果

3 討論

作者通過對電解前后的試液進行紫外光譜對比,發(fā)現(xiàn)電解前后紫外光譜圖變化不大,初步推斷出電解前后沒有新的共軛雙鍵生成,因此判斷氧化反應(yīng)不可能發(fā)生在與羰基碳相連的位置。結(jié)合實驗得出的SR電極動力學(xué)參數(shù),其電極反應(yīng)機制可認為是喹諾環(huán)N2與O發(fā)生了配位反應(yīng),反應(yīng)方程見圖6。

由于電化學(xué)反應(yīng)機制不可避免地涉及氧化還原過程,而在研究生命科學(xué)及藥物的藥理機制過程中往往涉及電荷的轉(zhuǎn)移。怎樣有效地通過多種電化學(xué)手段,從而獲取有關(guān)電化學(xué)反應(yīng)機制、藥理作用機制和生命化學(xué)機制等多種信息引起了分析化學(xué)工作者的極大關(guān)注[9]。

圖6 SR在玻碳電極上的反應(yīng)機制圖

通過對SR在玻碳電極上的電化學(xué)行為的研究,作者推導(dǎo)出了其在電極上的氧化反應(yīng)機制,有助于了解SR在體內(nèi)的氧化還原代謝機制,從而進一步闡明其在體內(nèi)的代謝狀況和過程。同時,該研究還建立了差示脈沖伏安法測定SR含量的新方法,為生物醫(yī)藥研究提供一定的理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

[1]洪閣,劉培勛.槐屬植物生物堿化學(xué)成分及藥理作用研究進展[J].中草藥,2005,36(5):783

[2]李雪梅,吳云光,潘達鑫,等.新型抗腫瘤藥槐定堿[J].中國新藥雜志,2006,15(8):654

[3]饒毅,魏惠珍,王明義,等.毛細管電泳法同時測定復(fù)方苦參注射液中三種生物堿含量[J].分析科學(xué)學(xué)報, 2003,19(3):225

[4]Wu YJ,Chen JJ,Cheng YY.A sensitive and specific HPLCMS method for the determination of sophoridine,sophocarpine and matrine in rabbit plasma[J].Anal Bioanal Chem,2005,382(7):1 595

[5]Wu YJ,Chen JJ,Cheng YY.Determination of sophocarpine, matrine and sophoridine in Kuhuang injection by GC-MS [J].JAnalytChem,2005,60(10):967

[6]姚慧琴,高作寧,韓曉霞,等.苦參堿類生物堿在玻碳電極上的直接電化學(xué)行為及電分析方法研究[J].中國中藥雜志,2005,30(10):765

[7]馬偉,孫登明.聚L-精氨酸修飾電極存在下同時測定多巴胺和腎上腺素[J].分析化學(xué),2007,35(1):66

[8]Bard AJ,Faulkner LR.Electrochemical methods fundamentals and app lications[M].New York:Wiley,1980:535

[9]董社英,韓曉峰,黃廷林.克拉霉素的電化學(xué)反應(yīng)機理研究與應(yīng)用[J].化學(xué)學(xué)報,2007,65(11):1 039