方 莉,李慶軍,方樹(shù)友

1)鄭州大學(xué)醫(yī)院檢驗(yàn)科鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科鄭州 450052△女,1969年3月生,本科,主管技師,研究方向:神經(jīng)疾病,E-mail:qrsy327@163.com

腦缺血/再灌注損傷機(jī)制迄今尚未完全闡明。近年研究[1]表明,TNF-α在缺血性腦血管病中起重要作用。腦缺血誘導(dǎo)的細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子 α (tumor necrosis factorα,TNF-α)等表達(dá)在腦炎癥反應(yīng)中起重要作用。雷公藤多糖甙(multi-glycosides of tripterygium wilfordii Hook F.,GTW)為雷公藤(tripterygium wilfordii Hook F.,TWHF)提取物,含有多種活性成分。體外實(shí)驗(yàn)[1]表明 GTW可抑制TNF-α的產(chǎn)生。作者建立了大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷模型,觀察GTW對(duì)血清TNF-α水平的影響,探討腦血管病的發(fā)病機(jī)制及GTW的藥理作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑 健康Wistar大鼠132只,雌雄不限,體質(zhì)量 250～300 g,由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。GTW:10mg購(gòu)自湖南株州市制藥三廠出品,批號(hào)20070302。TNF-α放射免疫分析藥盒購(gòu)自北京北免東雅公司。

1.2 動(dòng)物模型的建立 大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷模型參照Longa等[3]方法建立,大鼠清醒后,觀察大鼠的體征,出現(xiàn)以下體征者表明模型的制作成功:①左側(cè)Homer's征。②右前肢癱瘓,將鼠尾提起,大鼠不能充分伸展右前肢;當(dāng)動(dòng)物右旋時(shí)其右前肢拖在腹下,與左前肢交叉成剪刀狀;當(dāng)左旋時(shí),其右前肢掌面向上,被拖在身體的右側(cè)。無(wú)上述體征者舍棄。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 大鼠 132只,隨機(jī)分為4組,每組33只:Ⅰ組為假手術(shù)組,進(jìn)行手術(shù)操作,但不穿線;Ⅱ組為手術(shù)組,即腦缺血/再灌注損傷組;Ⅲ組為腦缺血/再灌注損傷+生理鹽水治療組;Ⅳ組為腦缺血/再灌注損傷+GTW治療組。Ⅳ組于實(shí)驗(yàn)前3 d開(kāi)始灌胃給藥,GTW量為30mg/kg,每天2次,術(shù)前1 h加灌 1次。Ⅲ組給予等體積生理鹽水。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組及Ⅳ組分別于 1、3、6、12及 24 h時(shí)間點(diǎn)處死,每時(shí)間點(diǎn)6只,留取血清用放免法測(cè)定TNF-α含量。缺血 1 h/再灌注 24 h后每組斷頭處死每組 3只大鼠,取腦制作病理組織切片,HE染色后觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 10.0對(duì)各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清TNF-α含量進(jìn)行單因素方差分析,組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷后病理改變 Ⅰ組無(wú)梗死灶,神經(jīng)元結(jié)構(gòu)、形態(tài)正常,無(wú)間質(zhì)水腫(圖1A);Ⅱ組(圖1B)和Ⅲ組(圖1C)呈點(diǎn)狀壞死,神經(jīng)元胞體縮小,變形、核固縮,胞漿濃縮呈深伊紅染色,間質(zhì)水腫明顯(神經(jīng)元纖維疏松,神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞以及血管周?chē)幌对龃?。Ⅳ組多數(shù)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)較完整,形態(tài)相對(duì)正常,間質(zhì)水腫明顯減輕(圖1D)。

2.2 不同的再灌注時(shí)間各組大鼠血清中TNF-α的變化 見(jiàn)表1。

圖1 各組大鼠腦組織病理形態(tài)(HE,×400)A,B,C,D:分別為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ組。

表1 不同的再灌注時(shí)間各組大鼠血清中TNF-α的變化(n=6) μg/L

3 討論

Liu等[4]觀察到在缺血后 1 h缺血側(cè)神經(jīng)元即有TNF-αmRNA的表達(dá),12 h達(dá)高峰。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在大鼠腦缺血1 h/再灌注3 h時(shí)TNF-α濃度開(kāi)始升高,6 h達(dá)高峰,隨后下降,但 24 h仍高于假手術(shù)組,提示腦缺血/再灌注過(guò)程中TNF-α合成增加。

TNF-α對(duì)神經(jīng)元無(wú)直接毒性,而是通過(guò)廣泛的間接途徑產(chǎn)生繼發(fā)性損傷[5-7],誘導(dǎo)和刺激包括炎癥介質(zhì)、細(xì)胞壞死及凋亡相關(guān)因子在內(nèi)的急性期蛋白分泌;參與并促進(jìn)腦缺血急性期“瀑布效應(yīng)”,刺激興奮性氨基酸的釋放,促進(jìn)腦缺血后NMDA受體的激活及鈣超載損傷的級(jí)聯(lián)效應(yīng),激活核因子NF-κB調(diào)節(jié)黏附分子、細(xì)胞因子和化學(xué)因子的合成和分泌,影響膠質(zhì)細(xì)胞、基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)和破壞細(xì)胞間通信,惡化腦缺血后內(nèi)環(huán)境紊亂和組織損傷,觸發(fā)多種凋亡機(jī)制,介導(dǎo)神經(jīng)元的凋亡,因此,下調(diào)TNF-α水平可以改善腦缺血的預(yù)后。

作為抗炎藥物GTW能明顯抑制TNF-α的產(chǎn)生。體外實(shí)驗(yàn)[8]證實(shí)TWHF能明顯抑制單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞分泌 TNF-α。在某些炎癥性動(dòng)物模型研究[9]中發(fā)現(xiàn),TWHF能明顯降低這些模型中炎癥細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β等的濃度,減輕炎癥反應(yīng),促進(jìn)機(jī)體恢復(fù)。該實(shí)驗(yàn)中也有類(lèi)似發(fā)現(xiàn),大鼠腦缺血再灌注損傷后,GTW可以降低再灌注3～24 h時(shí)的血清 TNF-α的水平,Ⅳ組為腦缺血/再灌注損傷后30mg/kg雷公藤多糖甙治療組,結(jié)果表明多數(shù)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)較完整,形態(tài)相對(duì)正常,間質(zhì)水腫明顯減輕。該研究提示 GTW可以減輕腦缺血/再灌注后炎癥反應(yīng),從而減輕腦缺血/再灌注損傷,對(duì)腦缺血/再灌注損傷有保護(hù)作用。

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