郭長青,邵經(jīng)浩,盧瑞利,曹新廣

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院消化內科鄭州 450052 2)河南省腫瘤醫(yī)院胃鏡室鄭州 450003

△男,1966年10月生,博士,教授,主任醫(yī)師,研究方向:消化道腫瘤,E-mail:cqguo6610@hotmail.com

自噬是細胞利用溶酶體降解自身受損的細胞器和大分子物質的過程,是真核細胞特有的生命現(xiàn)象。自噬廣泛存在于正常的生理過程(如細胞廢物的清除、結構重建及生長分化),又是細胞對不良環(huán)境的一種防御機制(如對抗營養(yǎng)缺乏、電離輻射),同時還參與多種疾病的病理過程[1-2]。自噬的調控機制非常復雜。beclin 1基因是自噬特種基因,參與自噬體的形成,可以通過提高自噬來抑制腫瘤的生長,是候選的腫瘤抑制基因[3]。PTEN可使細胞自噬機制開啟[4],從而抑制腫瘤的發(fā)展。作者采用免疫組化方法檢測胃癌組織中Beclin 1和PTEN蛋白的表達,了解在胃癌的發(fā)生和發(fā)展過程中自噬活性的改變,以進一步揭示胃癌發(fā)生發(fā)展的機制,并為胃癌的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標本來源 62例胃癌和 36例正常胃組織標本均來自鄭州大學第一附屬醫(yī)院病理科 2007年 1月至 7月手術切除標本存檔蠟塊。正常胃組織來源于手術切端組織和胃鏡室取材標本,均經(jīng)病理檢查證實。62例胃癌患者中,男 49例,女 13例;年齡34.0～75.0(60.6±10.4)歲,其中 ＜60歲25例,≥60歲 37例;均經(jīng)病理檢查確診,其中高分化腺癌 30例,中低分化癌(包括印戒細胞癌)32例;未浸及漿膜 40例,浸及漿膜 22例;有淋巴結轉移 34例,無淋巴結轉移28例;術前均未行放化療。

1.2 2種組織中Beclin 1及PTEN蛋白的檢測采用免疫組化法檢測,試劑盒購自Santa Cruz公司。組織蠟塊切片,烤片后脫蠟至水,高壓抗原修復,依次滴加過氧化物酶阻斷液(37℃封閉40min)、體積分數(shù)10%非免疫血清(37℃孵育40 min)、第一抗體(稀釋度均為1:50,4℃過夜),生物素標記的第二抗體(37℃孵育20min)及鏈酶親和素-生物素-辣根過氧化物酶工作液(37℃孵育20min),DAB顯色,蘇木素復染,脫水透明,中性樹膠封片。用已知陽性切片作陽性對照,用PBS代替一抗作陰性對照。

1.3 結果判斷標準 Beclin 1和PTEN的判斷標準相同。細胞質內出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞。觀察5個高倍視野(×400)或計數(shù) 500個細胞。按染色強度評分:無色為 0分,淡黃色為 1分,棕黃色為 2分,棕褐色為 3分。再按陽性細胞所占的百分比評分:陰性為 0分,陽性細胞 ＜10%為1分,10%～為2分,50%～為 3分,75%～為 4分。2項評分的乘積 ＞3為陽性[5]。

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 10.0處理數(shù)據(jù)。胃癌及正常組織中Beclin 1和PTEN蛋白表達的比較及胃癌組織不同臨床病理特征中 2者表達的比較采用χ2檢驗,計算胃癌組織中Beclin 1和PTEN表達的列聯(lián)系數(shù),檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 胃正常及癌組織中Beclin 1和PTEN蛋白的表達情況 見圖1、表1。

圖1 胃正常及癌組織中Bechin 1和PTEN蛋白的表達(SP,×400)A:胃腺上皮細胞中Beclin 1蛋白的表達;B:胃癌細胞中Beclin 1蛋白的表達;C:胃腺上皮細胞中PTEN蛋白的表達;D:胃癌細胞中PTEN蛋白的表達。

表1 胃正常及癌組織中Beclin 1及PTEN蛋白的表達

2.2 胃癌組織中Beclin 1和PTEN蛋白的表達與臨床病理特征的關系 見表2。

表2 Beclin 1及PTEN蛋白的表達與胃癌臨床病理特征的關系

2.3 胃癌組織中Beclin 1和PTEN蛋白表達的關聯(lián)性 見表3。

表3 胃癌組織中Beclin 1與PTEN蛋白表達的關聯(lián)性分析

3 討論

近 10年來,隨著酵母模型的建立和基因技術的發(fā)展,人們對自噬的機制和功能的了解才逐漸深入[6]。目前已經(jīng)至少鑒定出 31種參與酵母自噬的特異性基因,另外還有 50多種自噬相關基因[7]。所有自噬有關的特異基因統(tǒng)一命名為atg(autophagy gene)。多種癌基因抑制自噬,而一些腫瘤抑制蛋白誘導自噬[7]。最近報道[8]的 Atg4B是一種在哺乳動物中抑制自噬降解的蛋白酶,為自噬的研究提供了實驗性的方法。

beclin 1基因是酵母atg6/vps30基因在哺乳動物中的同源物,位于人類染色體 17q21上,大約有150 000 bp,被認為是一種雙等位抑癌基因,其雜合性缺失是細胞發(fā)生惡性轉化的原因之一[9]。Yue等[10]發(fā)現(xiàn)beclin 1缺失的大鼠中自噬表現(xiàn)的形成有缺陷而且惡性腫瘤的發(fā)生率明顯提高,可以認為beclin 1是新型的腫瘤抑制基因。Beclin 1蛋白是一個與凋亡抑制蛋白Bcl-2相互關聯(lián)的卷曲螺旋蛋白,在人類正常組織中廣泛表達。作者發(fā)現(xiàn)胃癌組織中Beclin 1蛋白的陽性表達率低于正常組織,Beclin 1蛋白表達與胃癌組織的分化程度有關,分化程度越低,其陽性表達率也越低,提示胃癌發(fā)生、發(fā)展中自噬活性的下降可能與腫瘤的演進和不良預后有關。

PTEN是目前發(fā)現(xiàn)的第一個具有脂質磷酸酶活性的抑癌基因,PTEN蛋白是多功能蛋白,能夠使其底物3,4,5-三磷酸肌醇(PIP3)去磷酸化而失活。磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)/AKT(PKB)途徑是自噬調控的重要通路,PTEN可抑制PI3K/PKB通路,上調自噬,PTEN突變可導致AKT通路的激活和自噬的抑制[4],在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起作用。作者觀察到,胃癌組織中PTEN的陽性表達率低于正常組織;胃癌組織的分化程度越低、浸潤深度越深、有淋巴轉移,其PTEN的陽性表達率也越低;提示PTEN也可能通過自噬參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。胃癌組織中Beclin 1與PTEN蛋白的表達密切關聯(lián),說明2者協(xié)同參與了胃癌的發(fā)生與發(fā)展.

目前,誘導腫瘤細胞自噬性死亡已成為腫瘤治療的新策略。對自噬調控機制的研究將為胃癌的化療提供新的方案,并為新藥開發(fā)提供可靠的理論依據(jù)。

[1]Qin ZH,Gu ZL.Huntingtin processing in pathogenesis of Huntington disease[J].Acta Pharmacol Sin,2004,25 (10):1 243

[2]Akazawa H,Komazaki S,Shimomura H,et al.Diphtheria toxin-induced autophagic cardiomyocyte death p lays a pathogenic role in mouse model of heart failure[J].J Biol Chem,2004,279(39):41 095

[3]Liang XH,Jackson S,Seaman M,etal.Induction of autophagy and inhibition of tumorigenesis by Beclin 1[J]. Nature,1999,402(6 762):672

[4]Arico S,Petiot A,Bauvy C,et al.The tumor supp ressor PTEN positively regulatesmacroautophagy by inhibiting the phosphatidy,linositol 3-kinase/protein kinase B pathway [J].JBiol Chem,2001,276(38):35 243

[5]許良中,楊文濤.免疫組織化學反應結果的判斷標準[J].中國癌癥雜志,1996,6(4):229

[6]Klionsky DJ.Autophagy:from phenomenology to molecular understanding in less than a decade[J].Nat Rev Mol Cell Biol 2007,8(11):931

[7]Meijer AJ,Codogno P.Regulation and roleofautophagy in mammalian cells[J].Int JBiochem Cell Biol,2004,36 (12):2 445

[8]Fu jita N,Noda T,Yoshimori T.Atg4B(C74A)ham pers autophagosome closure:a useful p rotein for inhibitingautophagy[J].Autophagy,2009,5(1):88

[9]Klionsky DJ,Emr SD.Autophagy as a regulated pathway of cellular degradation[J].Science,2000,290(5 497):1 717

[10]Yue Z,Horton A,Bravin M,et al.A novel p rotein complex linking the delta 2 glutamate receptor and autophagy: implications forneurodegeneration in lurcher mice[J]. earon,2002,35(11):921