趙 燕,姚志華,馬 杰,劉艷艷,楊樹軍#,劉 濤

1)河南省腫瘤醫(yī)院內(nèi)科鄭州 450008 2)河南省腫瘤醫(yī)院病理科鄭州 450008 #通訊作者,男,1965年1月生,本科,主任醫(yī)師,研究方向:惡性腫瘤

由于缺乏典型的臨床癥狀及靈敏的檢測手段,絕大部分胰腺癌患者就診時已屬晚期,失去手術(shù)機(jī)會,5 a生存率僅為 1%～5%[1]。異常的信號傳導(dǎo)通路是多數(shù)腫瘤發(fā)生發(fā)展的主要機(jī)制之一。P21ras蛋白為重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物,轉(zhuǎn)化生長因子-α(transforming growth factor-alpha,TGF-α)及表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)為生長信號的發(fā)放者。作者利用免疫組織化學(xué)法檢測 3種蛋白在胰腺癌組織中的表達(dá)情況,探討其與胰腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 收集河南省腫瘤醫(yī)院 2001年3月至2007年 7月普通外科手術(shù)切除并經(jīng)病理確診的原發(fā)性胰腺導(dǎo)管腺癌標(biāo)本 30例,患者男 20例,女 10例,年齡 30～76歲;胰頭部癌 25例,其他部位癌 5例;按國際抗癌聯(lián)盟(UICC)胰腺癌(1987)病理分級標(biāo)準(zhǔn),高、中分化癌21例,低分化癌9例;按UICC胰腺癌 TNM分期系統(tǒng),Ⅰ～Ⅱ期 16例,Ⅲ～Ⅳ期14例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 13例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 17例?；颊咝g(shù)前均未接受化療和放療。以該院手術(shù)切除的胰腺良性病變標(biāo)本中的正常胰腺組織 10例作對照。1.2 P21ras、TGF-α及EGFR蛋白檢測 采用免疫組化SP法檢測。鼠抗人P21ras單克隆抗體、鼠抗人TGF-α單克隆抗體及兔抗人EGFR多克隆抗體均購于美國Santa Cruz公司,抗體稀釋度1:50;超敏SP(廣譜)試劑盒及DAB試劑盒購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。標(biāo)本石蠟包埋,4μm厚切片,二甲苯脫蠟,乙醇梯度水化,體積分?jǐn)?shù) 3%H2O2甲醇溶液消除內(nèi)源性過氧化物酶,高壓水煮修復(fù)抗原,滴加一抗4℃過夜,PBS漂洗,依次滴加生物素標(biāo)記的二抗及鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶,DAB顯色,蘇木素復(fù)染。用已知的陽性切片作陽性對照,以PBS代替一抗作陰性對照。

1.3 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)[2-3]高倍鏡(×400)下選取 5個視野進(jìn)行觀察,每個視野觀察細(xì)胞不少于 200個。P21ras蛋白:以胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒且著色細(xì)胞數(shù)≥5%為陽性表達(dá)。TGF-α:以胞質(zhì)和(或)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒且著色細(xì)胞數(shù)≥10%為陽性表達(dá)。EGFR:以胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒和(或)胞膜出現(xiàn)棕黃色染色且著色細(xì)胞數(shù)≥20%為陽性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 15.0進(jìn)行統(tǒng)計處理,胰腺癌與正常組織 3種蛋白表達(dá)的差異及不同臨床病理特征胰腺癌組織中 3種蛋白表達(dá)的差異采用確切概率法分析,對胰腺癌組織中TGF-α與EGFR蛋白表達(dá)的關(guān)系進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析,計算列聯(lián)系數(shù),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 P21ras、TGF-α及EGFR蛋白檢測結(jié)果 見圖1、表1。胰腺癌組織中P21ras的表達(dá)不均勻且異質(zhì)性明顯,呈局灶性或彌漫性分布;正常胰腺組織中僅個別表達(dá),且呈局灶性分布。胰腺癌組織中TGF-α及EGFR均呈彌漫性表達(dá),正常胰腺組織中TGF-α及EGFR僅個別病例呈局灶性表達(dá)或不表達(dá)。3種蛋白在胰腺癌組織中的表達(dá)水平均高于正常胰腺組織。

圖1 正常胰腺及胰腺癌組織中P21ras、TGF-α及EGFR蛋白的表達(dá)(SP,×400)A 1,A 2:胰腺癌及正常胰腺組織中P21ras蛋白的表達(dá);B 1,B2:胰腺癌及正常胰腺組織中TGF-α蛋白的表達(dá);C 1,C2:胰腺癌及正常胰腺組織中EGFR蛋白的表達(dá)。

表1 胰腺正常及癌組織中P 21ras、TGF-α及EGFR蛋白的表達(dá)例(%)

2.2 P21ras、TGF-α及EGFR蛋白表達(dá)與胰腺癌臨床病理特征的關(guān)系 見表2。由表2可知,P21ras蛋白的表達(dá)與胰腺癌的病理分級、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),TGF-α、EGFR與胰腺癌的病理分級、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。

2.3 胰腺癌組織中TGF-α及EGFR表達(dá)的關(guān)聯(lián)性分析 見表3。

表2 P 21ras、TGF-α及EGFR表達(dá)與胰腺癌臨床病理特征的關(guān)系 陽性例數(shù)(%)

表3 胰腺癌中TGF-α與EGFR表達(dá)的關(guān)聯(lián)性分析 例

3 討論

細(xì)胞發(fā)生癌變主要由于兩方面的異常:一方面為胞外和(或)胞內(nèi)控制細(xì)胞生長增殖的信號增多,如生長因子及生長因子受體過表達(dá);另一方面為細(xì)胞增殖信號從細(xì)胞表面向核內(nèi)傳導(dǎo)過程中,某個或某些環(huán)節(jié)如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物、蛋白激酶及轉(zhuǎn)錄激活物發(fā)生改變,使細(xì)胞生長失去正常生理信號的調(diào)控,從而產(chǎn)生腫瘤的各種生物學(xué)和病理學(xué)特征。

研究[4]顯示,90%的胰腺癌患者存在k-ras基因突變,k-ras基因通過在 12、13或 61位密碼子的突變而大量活化,造成其編碼蛋白 P21ras大量表達(dá),同時也使P21ras蛋白的空間構(gòu)型和功能發(fā)生改變,使P21ras蛋白處于持續(xù)活化狀態(tài),不斷向下游發(fā)放生長信號,從而改變了正常細(xì)胞的生長與調(diào)控,使細(xì)胞進(jìn)入增殖周期,阻止細(xì)胞發(fā)生分化。反義k-ras基因可下調(diào)k-rasmRNA和P21蛋白表達(dá),從而抑制胰腺癌細(xì)胞的增生并促進(jìn)凋亡,說明P21ras蛋白大量表達(dá)參與了胰腺癌的發(fā)生與發(fā)展[5]。作者的研究結(jié)果顯示,胰腺癌組織中P21ras蛋白的表達(dá)高于正常胰腺組織,且在高、中分化、Ⅰ ～Ⅱ期及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中的表達(dá)高于低分化、Ⅲ～Ⅳ期及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織,與李淑德等[6]結(jié)果一致,提示P21ras蛋白的表達(dá)是胰腺癌一早期而普遍的事件,檢測P21ras蛋白有助于胰腺癌的早期診斷。

TGF-α是一類在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用的生長因子,它能夠與EGF競爭,與EGFR結(jié)合,激活EGFR胞內(nèi)區(qū)的酪氨酸激酶,繼而催化其下游的靶蛋白的磷酸化,從而將細(xì)胞外信號傳遞到細(xì)胞內(nèi),最終促進(jìn)靶細(xì)胞的 DNA合成及有絲分裂。利用化學(xué)致癌劑誘導(dǎo)的大鼠胰腺導(dǎo)管腺癌[7]及人胰腺導(dǎo)管腺癌[8]組織中均可發(fā)現(xiàn)TGF-α及EGFR的過表達(dá)。作者的研究結(jié)果顯示,TGF-α與EGFR在胰腺癌組織中高表達(dá),但 2者的表達(dá)與胰腺癌的病理分級、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān);胰腺癌組織中 2者的表達(dá)密切關(guān)聯(lián)。Pina等[9]將EGFR抑制劑應(yīng)用于胰腺癌細(xì)胞系,發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞增殖抑制與凋亡的程度與TGF-α密切相關(guān)。許雅等[10]利用反義TGF-α及反義EGFR轉(zhuǎn)染胰腺癌PC-7細(xì)胞系構(gòu)建穩(wěn)定的雙重轉(zhuǎn)化細(xì)胞系,結(jié)果雙重轉(zhuǎn)化細(xì)胞系細(xì)胞更容易發(fā)生凋亡。上述研究結(jié)果均提示,TGF-α及EGFR參與了胰腺癌的形成,TGF-α/EGFR形成的自分泌環(huán)是胰腺癌形成的重要機(jī)制。

靶向性藥物是目前抗癌藥物研究的熱點(diǎn),胰腺癌分子靶向藥物的研究主要集中于單克隆抗體、酪氨酸激酶抑制劑、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑以及腫瘤疫苗等[11],尤其是針對EGFR的cetuximab及酪氨酸激酶抑制劑erlotinib[12-14]。作者的研究結(jié)果顯示P21ras、TGF-α及EGFR有可能成為胰腺癌藥物治療的靶點(diǎn),為靶向藥物的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

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