張軍輝,趙玉林,張 勇

鄭州大學第一附屬醫(yī)院耳鼻喉科鄭州 450052

#通訊作者,男,1964年10月生,教授,主任醫(yī)師,研究方向:頭頸部腫瘤的防治

近來臨床研究[1]證明,對于局部進展期的腫瘤使用新輔助化療可縮小腫瘤體積,提高手術根治性切除率,改善治療效果。近年來發(fā)現(xiàn)丙戊酸鈉(sodium valproate,VPA)是一種組蛋白去乙?；敢种苿?histone deacetylase inhibitors,HDIs),可以明顯抑制多種腫瘤細胞的增殖,誘導其凋亡[2]。喉癌是頭頸部常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率有逐年增高的趨勢,但缺乏針對喉癌的有效化療藥物。作者觀察了VPA對喉癌Hep-2細胞增殖及環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)和凋亡抑制蛋白Survivin表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人喉癌Hep-2細胞株購自南京凱基生物有限公司。RPMI 1640購自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司。小牛血清購自杭州四季青公司。VPA、噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)和Trizol等試劑購自Sigma公司;逆轉錄試劑盒和dNTPs購自寶生物(大連)有限公司;Taq DNA聚合酶購自Promega公司;DNAMarker購自天根生化科技有限公司;PCR引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2 細胞培養(yǎng)和藥物處理 Hep-2細胞接種于含體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中(青霉素和鏈霉素各100 kU/L),置37℃、體積分數(shù)為5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。將VPA溶于RPMI 1640培養(yǎng)液制成1 000mmol/L的母液,過濾除菌后-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 增殖抑制實驗 消化收集對數(shù)生長期細胞后計數(shù)并調整細胞濃度,按 100μL/孔接種于96孔板。加入含VPA終濃度為1、2、3、4、5mmol/L的RPMI 1640完全培養(yǎng)基。每組設6個復孔。不加VPA僅用培養(yǎng)基為陰性對照。不加細胞只加培養(yǎng)液孔為調零孔。培養(yǎng)12、24、36、48、60及72 h,每孔加入5 g/L MTT溶液20μL,培養(yǎng)箱內繼續(xù)孵育 4 h,終止培養(yǎng)。小心吸棄培養(yǎng)上清液,每孔加入DMSO 150μL,振蕩10min,于酶聯(lián)免疫檢測儀上測570 nm波長處的吸光度(A),計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=(陰性對照組A-給藥組A)/陰性對照組A×100%。實驗重復3次。

1.4 Hep-2細胞COX-2和Survivin mRNA檢測采用Trizol抽提法提取3 mmol/L VPA分別作用0、24、48及72 h后的Hep-2細胞的總RNA,電泳檢測純度,取適量RNA為模板逆轉錄得cDNA。取適量cDNA作模板,以β-actin為內參照,進行PCR。PCR擴增引物序列如下:COX-2上游5'-GTCTGATGATG TATGCCACAATCTG-3',下游5'-GATGCCAGTGAT AGAGGGTGTTAAA-3',退火溫度60℃,擴增片段大小276 bp。Survivin上游5'-CAGATTTGAATCGCGG GACCC-3',下游5'-CCAAGTCTGGCTCGTTCTCAG-3',退火溫度61℃,擴增片段大小208 bp。β-actin引物上游5'-GCAGCCGTGGCCATCTCTTGCTC-3';下游5'-AACCGCGAGAAGATGACCCAGATC-3',擴增片段大小350 bp。反應條件為94℃4min;94℃30 s,退火30 s,72℃60 s,28個循環(huán);最后72℃10 min。反應完成后取5μL PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像儀掃描成像。以目的基因與β-actin mRNA條帶光密度的比值表示mRNA的相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學處理 應用SAS 6.12和SPSS 13.0進行統(tǒng)計學處理。不同組別不同時間點細胞生長抑制率、COX-2及Survivin mRNA相對表達量的比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗,檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 VPA對Hep-2細胞增殖的影響 增殖抑制實驗結果見表1。可知,VPA對Hep-2細胞有明顯的生長抑制作用,并呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性和時間依賴性。

表1 5組細胞增殖抑制率測定結果(n=3) %

2.2 VPA對Hep-2細胞COX-2和Survivin m RNA表達的影響 RT-PCR結果見圖1。

圖1 3mmo l/L VPA作用不同時間后Hep-2細胞COX-2(上)及Survivin(下)mRNA的表達M:Marker;1:0h;2:24 h;3:48h;4:72 h。

Hep-2細胞COX-2和Survivin mRNA測定結果見表2?？芍?3 mmol/L VPA作用后Hep-2細胞中COX-2和Survivin mRNA的表達下調。

表2 VPA對Hep-2細胞中COX-2和Survivin mRNA影響的表達(n=3)

3 討論

近年研究[3]表明,臨床上作為一線抗癲癇病藥物的VPA在抗癲癇病有效治療濃度時表現(xiàn)出很強的HDIs活性,從而抑制腫瘤細胞的增殖,VPA還參與調節(jié)腫瘤細胞增殖、誘導分化及凋亡等有關基因的表達而達到治療腫瘤的目的。作者也發(fā)現(xiàn),VPA可抑制Hep-2細胞的增殖,該作用表現(xiàn)出劑量和時間依賴性。

誘導型環(huán)氧化酶即COX-2是花生四烯酸轉變成前列腺素的主要限速酶之一,近年研究[4-5]表明,其在多種腫瘤組織中過度表達,通過促進增殖、抑制凋亡、提高腫瘤發(fā)生及轉移的潛能、抑制免疫、誘導前致癌物活化、促使癌基因及抑癌基因活性改變等多種致癌機制參與腫瘤增殖轉移過程。體內外實驗[6-7]也證實COX-2抑制劑可預防某些腫瘤的發(fā)生,抑制腫瘤生長、增殖及轉移。因此,COX-2成為當前腫瘤防治的靶點。作者觀察到,VPA可下調喉癌Hep-2細胞COX-2mRNA的表達,且呈時間依賴性。

Survivin是迄今為止發(fā)現(xiàn)的抑制凋亡作用最強的因子,是近幾年來國內外腫瘤研究中的一個熱點[8-9]。survivin還有可能作為一種抗凋亡保護性基因參與血管生成[10]。作者觀察到,VPA作用于喉癌Hep-2細胞后,細胞中survivinmRNA的表達下調,且呈時間依賴性。

總之,該研究結果表明,VPA可以抑制喉癌Hep-2細胞的增殖,該作用可能與下調COX和Survivin的表達有關。VPA抗腫瘤的內在機制很復雜,而COX-2和Survivin可能只是其中的一個方面,關于VPA如何引起COX-2和Survivin基因的變化, VPA是否通過其他途徑引起腫瘤細胞生長抑制,從而起到抗腫瘤的作用,均需要進一步探討。

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