曹 華,周曉紅,黃新莉,趙潤生,凌亦凌,張雪靜

河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)課教學(xué)部病理學(xué)教研室石家莊 050091

#通訊作者,女,1970年5月生,博士,副教授,研究方向:肺的病理生理研究,E-mail:zzxxhh2007@sina.com

老年人易患肺部感染,進(jìn)而引發(fā)急性肺損傷(acute lung injury,ALI)。ALI的主要病變特點表現(xiàn)為急性彌漫性肺泡和肺血管損傷,最終可發(fā)展至急性呼吸窘迫綜合征,病死率極高,具體發(fā)病機(jī)制不明。內(nèi)源性氣體信號分子如CO和NO在ALI中的作用已得到多方證實[1-3]。硫化氫(H2S)可能是繼 NO和 CO之后發(fā)現(xiàn)的另一種氣體信號分子[4],參與神經(jīng)和血管的功能調(diào)節(jié)等多種生理和病理過程[5-7]。有學(xué)者[8]發(fā)現(xiàn)在離體器官水平H2S和NO共同參與了脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)所致的大鼠肺動脈反應(yīng)性異常,進(jìn)而推測老年大鼠ALI時,H2S和NO、CO之間可能存在某種聯(lián)系。因此,作者制備LPS致老年大鼠ALI模型,觀察ALI時肺組織損傷指標(biāo)、H2S及其生成關(guān)鍵酶胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase,CSE)、誘導(dǎo)型NO合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)/NO和血紅素加氧酶-1 (hemeoxygenase-1,HO-1)/CO體系的變化,探討H2S在LPS致ALI中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 大腸桿菌LPS(LPSE.coli O111:B4)、 NaHS、5'-磷酸吡哆醛、L-半胱氨酸、N,N-二甲基-對苯二胺硫酸鹽、輔酶Ⅱ、6-磷酸葡萄糖和 6-磷酸葡萄糖脫氫酶、血紅蛋白及血紅素均購自Sigma公司;抗HO-1多克隆抗體和抗iNOS多克隆抗體購自武漢博士德公司;SP免疫組織化學(xué)檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;NO與CO含量、iNOS與HO活性及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量檢測試劑盒購自南京建成生物技術(shù)有限公司。

1.2 實驗分組 清潔級健康雄性SD大鼠48只,20月齡,體質(zhì)量 350～400 g,購自河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。自由攝食、飲水,室溫 18～24℃,相對濕度40%～70%,每日 12 h光照維持,晝夜循環(huán)。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng) 1周后,隨機(jī)分為 3組,每組 16只。①對照組:氣管內(nèi)滴注生理鹽水(200μL/只)。②LPS組:氣管內(nèi)滴注LPS(溶于生理鹽水)200μg/只。③NaHS+LPS組:LPS滴注前10 min腹腔注射NaHS(溶于生理鹽水)28μmol/kg。每組分別于LPS給藥4及 8 h后,各取 8只進(jìn)行取樣觀察。

1.3 標(biāo)本制備 分別于滴注藥物后 4、8 h從頸總動脈放血處死動物,取血漿檢測NO、H2S和CO含量;稱量全肺以測定肺系數(shù);留取左側(cè)肺葉下部,以體積分?jǐn)?shù) 10%中性甲醛溶液固定,常規(guī)石蠟包埋、切片,用以觀察肺組織形態(tài)學(xué)變化及檢測HO-1、iNOS蛋白表達(dá)的變化;取左側(cè)肺葉中上部制備肺組織勻漿,用于檢測CSE、iNOS及HO活性和MDA含量。

1.4 測定指標(biāo)

1.4.1 肺系數(shù)測定 自氣管分叉以上 5、6軟骨環(huán)間剪斷氣管,用濾紙吸干肺表面血污后稱質(zhì)量。肺系數(shù)=全肺濕質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(kg)。

1.4.2 肺組織形態(tài)學(xué)觀察 光鏡下觀察肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。每組選取 6張切片,每張切片連續(xù)觀察10個視野(×100),肺泡內(nèi)含有2個以上紅細(xì)胞和(或)中性粒細(xì)胞為損傷肺泡。計算損傷肺泡數(shù)占計數(shù)肺泡總數(shù)的百分比,即肺泡損傷數(shù)比值(IQA),作為肺損傷的組織學(xué)定量評價指標(biāo)。

1.4.3 肺組織中MDA含量及CSE、iNOS活性的測定 采用硫代巴比妥酸法測定MDA含量。采用分光光度法測定肺組織iNOS活性,嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行操作。參照文獻(xiàn)[6]方法測定CSE活性。

1.4.4 肺組織中HO活性檢測 取肺組織,加4倍體積PBS(0.1 mol/L,pH 7.4)制成勻漿,4℃、15 000 g離心15min,取上清液-70℃保存。反應(yīng)體系含肺組織勻漿上清液20μL、血紅素20μmol/L、NADP 0.8 mmol/L、肝組織勻漿上清液20μL(作為膽綠素還原酶的來源)、6-磷酸葡萄糖4 mmol/L和6-磷酸葡萄糖脫氫酶1 U。37℃暗處反應(yīng)1 h,于冰上終止反應(yīng)。以不含輔酶Ⅱ的樣品作空白對照。用分光光度計于464和530 nm處測定吸光度。膽紅素消光系數(shù)為40 mmol/(L·cm)。計算1mg HO蛋白1 h催化血紅素降解生成膽紅素的量,以此表示 HO活性。肺組織勻漿上清液蛋白測定采用考馬斯亮藍(lán)法。

1.4.5 血漿中H2S、NO及CO含量測定 采用去蛋白的分光光度法[5]測定 H2S,根據(jù)H2S標(biāo)準(zhǔn)曲線計算上清液中 H2S的含量。采用硝酸還原酶法間接測定 NO,嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行操作。參照Chalmers等[9]的雙波長分光光度法測定CO,以血漿中HbCO的百分比含量(%)代表CO含量。

1.4.6 肺組織中iNOS和HO-1蛋白檢測 采用SP法檢測大鼠肺組織iNOS、HO-1蛋白表達(dá)。切片常規(guī)脫蠟、脫水,一抗滴度為1:100,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,脫水、透明并封片。以 PBS代替一抗作為陰性對照。細(xì)胞質(zhì)染成棕黃色的即為陽性細(xì)胞。每鼠取 5張切片,每張切片取 3～5個高倍視野,用全自動圖像分析系統(tǒng)檢測陽性細(xì)胞的光密度值,計算 5張切片的平均值,作為iNOS、HO-1蛋白的相對表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 11.5進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以ˉx±s表示,3組間各指標(biāo)的比較采用單因素方差分析,兩兩比較用SNK-q檢驗,檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠肺組織形態(tài)學(xué)的改變 光鏡下(圖1),對照組肺組織結(jié)構(gòu)正常。LPS組肺泡間隔增厚、斷裂,中性粒細(xì)胞浸潤,肺泡內(nèi)可見漿液、紅細(xì)胞,且大鼠的肺損傷隨時間的延長而加重。NaHS+LPS組肺組織病變較LPS組減輕,大部分肺組織接近正常,局部肺組織有少量炎性細(xì)胞浸潤,肺泡隔略有增寬。3組IQA的比較見表1。

圖1 3組大鼠肺組織形態(tài)學(xué)的變化(HE,×100)A:對照組;B:LPS組;C:NaHS+LPS組。

2.2 3組大鼠肺系數(shù)及肺組織MDA含量的比較見表1?？煽闯?LPS組肺系數(shù)及肺組織MDA含量均高于對照組和NaHS+LPS組,NaHS+LPS組又高于對照組。

2.3 3組大鼠肺組織中CSE、iNOS及HO活性的比較 見表2。

2.4 3組大鼠血漿H2S、NO及CO含量的比較 見表3。

2.5 3組大鼠肺組織中iNOS及HO-1蛋白的表達(dá)見圖2和表4。對照組肺組織中偶見iNOS和HO-1陽性細(xì)胞。LPS組肺組織中 2者的表達(dá)較對照組增強(qiáng),iNOS主要表達(dá)于肺泡間質(zhì)的單核-巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞及支氣管上皮細(xì)胞,HO-1主要分布于氣道上皮、肺泡壁、血管壁細(xì)胞和炎癥細(xì)胞的胞質(zhì)中。與LPS組比較,NaHS+ LPS組iNOS的表達(dá)減弱,HO-1的表達(dá)增加。

表1 3組大鼠肺組織IQA、肺系數(shù)及MDA含量測定結(jié)果(n=8)

表2 3組大鼠肺組織中CSE、iNOS及HO活性的比較(n=8)

表3 3組大鼠血漿H 2S、NO及CO含量的比較(n=8)

圖2 3組大鼠肺組織中iNOS及HO-1蛋白的表達(dá)(SP,×400)A 1,A 2:對照組iNOS及HO-1的表達(dá);B1,B2:LPS組iNOS及HO-1的表達(dá);C1,C2:NaHS+LPS組iNOS及HO-1的表達(dá)。

表4 3組大鼠肺組織中iNOS及HO-1蛋白相對表達(dá)量的比較(n=8)

3 討論

H2S具有多種生物學(xué)作用,如參與低氧性肺動脈高壓和感染性休克[5-6]以及緩解自發(fā)性高血壓血管重構(gòu)等[7]。作者的實驗結(jié)果顯示,LPS引起老年大鼠肺組織損傷的同時,血漿 H2S含量和肺組織CSE活性下降;預(yù)先給予H2S供體NaHS可使H2S含量和 CSE活性升高,肺損傷也明顯減輕。提示CSE/H2S體系的下調(diào)在LPS致ALI中有一定作用,而給予一定量的外源性 H2S對肺組織有保護(hù)作用。作者檢測了老年大鼠肺組織中 MDA含量,證明外源性H2S可一定程度上減少ALI時肺內(nèi)MDA的生成,提示H2S具有一定的抗氧化作用,H2S具有清除活性氧的作用[10]。

NO是最早發(fā)現(xiàn)的氣體信號分子,可參與多種肺疾病的發(fā)生[11]。NOS是合成NO的關(guān)鍵酶,iNOS誘導(dǎo)產(chǎn)生的過量NO具有細(xì)胞毒性作用[12]。CO具有抗炎、抗氧化等作用。機(jī)體內(nèi)源性CO主要由HO催化血紅素降解產(chǎn)生,誘導(dǎo)型HO(即HO-1)可作為保護(hù)性蛋白被細(xì)菌內(nèi)毒素、炎性細(xì)胞因子及NO等多種因素誘導(dǎo)表達(dá)[13]。作者發(fā)現(xiàn),LPS致老年大鼠ALI的同時,使肺組織中H2S減少,上調(diào)iNOS/NO體系和HO-1/CO體系,前者是LPS致?lián)p傷的機(jī)制之一,后者則可能是機(jī)體對抗損傷的一種保護(hù)性反應(yīng)。給予NaHS可下調(diào)iNOS/NO、上調(diào)HO-1/CO。由此推測,ALI時 3種氣體信號分子間可能存在相互調(diào)節(jié),具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

總之,實驗結(jié)果表明,CSE/H2S體系的下調(diào)參與了LPS所致老年大鼠ALI的發(fā)病,而外源性H2S可通過本身的抗氧化作用以及下調(diào)iNOS/NO體系、上調(diào)HO-1/CO體系發(fā)揮一定的抗損傷作用。

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