王 琳,徐春燕,劉新奎,師國珍#

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院放療科;河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點學(xué)科開放實驗室鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)學(xué)報編輯部鄭州450001 3)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病案管理科;河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點學(xué)科開放實驗室鄭州 450052

#通訊作者,男,1947年10月生,主任醫(yī)師,教授,研究方向:細胞藥物時相與放射線細胞時相的結(jié)合治療惡性腫瘤,E-mail: shiguozhen0371@126.com

目前,肺癌的發(fā)生率和病死率居世界癌癥之首,是一種治愈率極低的惡性腫瘤。熱療是繼手術(shù)、放療、化療與生物療法之后的第 5種療法。細胞培養(yǎng)、動物模型及臨床應(yīng)用均證明熱療可與化療產(chǎn)生協(xié)同作用[1]。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,在細胞存活途徑中起重要作用[2]?；罨?Akt,即磷酸化的Akt(p-Akt)在抑制細胞凋亡,促進細胞增殖、運動和侵襲等方面起重要作用[3],而以上各過程均與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。研究[4-5]顯示,多種腫瘤組織中存在p-Akt的高表達。該研究中作者將加熱與臨床常用的化療藥物紫杉醇聯(lián)用,探討熱化療對 H446細胞生長增殖、侵襲及Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響,為闡明熱化療作用的可能機制和臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 細胞株:人小細胞肺癌細胞株H446為中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院營養(yǎng)所饋贈。主要試劑:紫杉醇注射液(太極集團四川太極制藥有限公司),噻唑藍(Sigma公司),兔抗人Akt抗體和p-Akt(Ser473)抗體(美國Cell Signaling公司),辣根酶標記山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),Akt特異抑制劑wortmannin(美國Alexis公司)。主要儀器:垂直電泳槽,電轉(zhuǎn)儀,Sunrise酶標儀,恒溫水浴箱。

1.2 實驗分組 紫杉醇所用劑量參考臨床常用劑量。按如下方式處理細胞:單純化療組(加入 120 μg/L紫杉醇,37℃培養(yǎng)24 h)、熱化聯(lián)合組(加入120μg/L紫杉醇,43℃水浴加熱 40min,37℃培養(yǎng)48 h)、wortmannin組(加入120μg/L紫杉醇及1 μmol/L wortmannin 43℃水浴加熱40 min,37℃培養(yǎng)48 h)及對照組(37℃培養(yǎng)48 h)。

1.3 損傷修復(fù)實驗 取對數(shù)生長期細胞,常規(guī)消化制成單細胞懸液,接種于 24孔板中,每孔 1×105個細胞,每組設(shè) 3個復(fù)孔;待細胞完全融合時,用 20 μL Tip頭在單層細胞上劃痕,倒置顯微鏡下照相,記錄劃痕的原始大小,并按設(shè)計處理細胞;分別于劃痕 24及 48 h后照相,記錄劃痕寬度的變化。

1.4 H446細胞增殖率檢測 采用MTT法。取對數(shù)生長期的 H446細胞,常規(guī)消化制成單細胞懸液,調(diào)整細胞密度為2.5×104m L-1,接種于96孔板中,每孔0.2m L,置37℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,待細胞貼壁,按實驗設(shè)計處理細胞(每組設(shè)6個復(fù)孔,獨立重復(fù)3次),之后放回37℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h;每孔加入5 g/L MTT液20μL,繼續(xù)孵育4 h,取出培養(yǎng)板,棄去MTT液,每孔加入150μL二甲基亞砜(DMSO),微量振蕩器振蕩10 min,使結(jié)晶物充分溶解,以DMSO調(diào)零,酶聯(lián)免疫檢測儀檢測492 nm波長下每孔的吸光度值(A),計算細胞生長增殖率,細胞生長增殖率= (實驗組A值/對照組A值)×100%。

1.5 各組細胞p-Akt水平檢測 離心收集各組細胞,將約1×106個細胞置于細胞裂解液中,在冰水浴中反復(fù)吹打進行破碎,4℃、10 000 r/min離心 10 min,吸取上清液,即為細胞提取液。進行總蛋白定量,調(diào)整蛋白濃度一致后,進行SDS-PAGE電泳,然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,分別以兔抗人Akt抗體和兔抗人p-Akt抗體為一抗,辣根酶標記山羊抗兔IgG為二抗,進行Western Blot分析,化學(xué)發(fā)光法顯色后,應(yīng)用GeneTool圖像分析軟件進行定量分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0對數(shù)據(jù)進行處理,4組增殖率和p-Akt水平比較采用單因素方差分析,LSD法進行兩兩比較,檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 損傷修復(fù)實驗結(jié)果 劃痕后24 h,對照組細胞開始向劃痕區(qū)生長,劃痕區(qū)中央可見散在的細胞,其余各組劃痕區(qū)均未見細胞生長,且有部分細胞死亡,熱化聯(lián)合組細胞存活數(shù)少,加入 Ak t抑制劑組存活細胞數(shù)更少;劃痕后 48 h,對照組細胞劃痕區(qū)已填充,單純化療組細胞大部分存活,但仍存在較寬的劃痕區(qū),熱化聯(lián)合組和抑制劑組細胞大多已死亡。

2.2 各組細胞增殖率和p-Akt水平比較 見圖1,表1。

圖1 各組p-Ak t水平比較

表1 各組細胞增殖率和p-Ak t水平比較(n=3)

3 討論

腫瘤熱療是一種新的腫瘤治療方法,能夠在有效的溫度范圍內(nèi)提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性,逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的耐藥[6],誘導(dǎo)細胞凋亡[4]。該研究結(jié)果顯示,單純化療和熱化療均可使細胞增殖率降低,且熱化療聯(lián)合對細胞增殖的抑制作用更強,提示加熱可增加細胞對化療藥物紫杉醇的敏感性。

損失修復(fù)實驗?zāi)苣M體內(nèi)傷痕康復(fù)過程中細胞遷移的情況[7],較好地反映細胞的遷移能力[8],在一定程度上反映細胞增殖能力和修復(fù)能力[9-10]。該研究結(jié)果顯示,與對照組相比,化療和熱化療聯(lián)合組細胞的遷移能力均受到嚴重影響,且熱化療聯(lián)合組影響更大,劃痕后不易長滿劃痕區(qū),細胞瀕于死亡。加入抑制劑后,存活細胞數(shù)目進一步減少。

Akt是體內(nèi)重要的生存信號通路磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt中的關(guān)鍵分子。p-Akt水平的增加可導(dǎo)致PI3K/Akt細胞生存通路的活化,大多數(shù)腫瘤組織中都有p-Akt的過度表達[5],通過抑制Akt的表達和活化,不僅可以阻斷它的致癌作用,而且可以阻斷此通路上游多種致癌相關(guān)基因,如生長因子類癌基因、生長因子受體類癌基因、ras癌基因與PTEN抑癌基因等。因此,PI3K/Ak t通路是介導(dǎo)細胞存活的一條經(jīng)典通路,抑制了其表達,細胞的存活率就會降低。該研究結(jié)果顯示,p-Akt在對照組中高表達,在熱化療聯(lián)合組中降低,在抑制劑組最低,與增殖率降低的趨勢一致,推測熱化療抑制細胞增殖可能與抑制p-Akt水平有關(guān)。

p-Akt可以增加腫瘤細胞的運動功能,有助于癌細胞侵襲,同時可以促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移[11]。從該實驗可以看出,熱療抑制腫瘤細胞的遷移可能與熱療減少p-Akt的表達有關(guān)。

綜上所述,熱化療聯(lián)合應(yīng)用可抑制 H446細胞增殖,其作用可能是通過抑制Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實現(xiàn)的。

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