劉新奎1,2),王 琳3),張明智2)#

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病案管理科;河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科鄭州 450052 3)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院放療科;河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室鄭州 450052

#通訊作者,男,1959年1月生,博士,教授,主任醫(yī)師,研究方向:惡性淋巴瘤的基礎(chǔ)與臨床,E-mail:mingzhi_zhang@126.com

淋巴瘤是一組原發(fā)于淋巴結(jié)和(或)結(jié)外部位淋巴組織的淋巴細(xì)胞或組織細(xì)胞的惡性腫瘤[1]。淋巴瘤的臨床治療主要有化療、放療及造血干細(xì)胞移植治療,但均存在選擇性不高的缺點(diǎn),治療中常出現(xiàn)較明顯的毒副反應(yīng),且易復(fù)發(fā)。熱療被認(rèn)為是繼手術(shù)、放療、化療及生物療法之后的第 5種治療腫瘤的方法[2]。該研究中作者將加熱與治療淋巴瘤常用的化療藥物阿霉素聯(lián)合應(yīng)用,觀察其對(duì)人淋巴瘤Raji細(xì)胞生長(zhǎng)以及c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和熱休克蛋白70(HSP70)表達(dá)的影響,探討熱化療作用的可能機(jī)制,為腫瘤熱療的臨床實(shí)踐提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、主要試劑與儀器 細(xì)胞株:Raji細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞研究所。主要試劑:阿霉素注射液(太極集團(tuán)四川太極制藥有限公司)、噻唑藍(lán)(Sigma公司)、鼠抗人HSP70單克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)、兔抗人JNK抗體和p-JNK (Thr183/Tyr185)抗體(美國(guó)Cell Signaling公司)、辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠 IgG和辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。主要儀器:垂直電泳槽、電轉(zhuǎn)儀、Sunrise酶標(biāo)儀及恒溫水浴箱。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 參考臨床常用劑量,按如下方式進(jìn)行分組:單純化療組(加入3.00 mg/L阿霉素,37℃培養(yǎng)24 h)、單純熱療組(43℃水浴加熱30 min,37℃培養(yǎng)24 h)、熱化療組(加入3.00mg/L阿霉素, 43℃水浴加熱 30 min,37℃培養(yǎng) 24 h)及對(duì)照組(37℃培養(yǎng)24 h)。

1.3 細(xì)胞增殖率測(cè)定 采用MTT法檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,常規(guī)消化制成單細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×104mL-1,接種于 96孔板,每孔 0.2 mL,置37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,按1.2中設(shè)計(jì)處理細(xì)胞后放回37℃、體積分?jǐn)?shù) 5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h;每孔加入5 g/L MTT液20μL,繼續(xù)孵育4 h,取出培養(yǎng)板,加入150μL二甲基亞砜(DMSO),微量振蕩器振蕩10 min,以DMSO調(diào)零,酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)492 nm波長(zhǎng)下每孔的吸光度(A)值。每組設(shè) 6個(gè)復(fù)孔,重復(fù) 3次。細(xì)胞生長(zhǎng)增殖率=(實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%。

1.4 各組細(xì)胞JNK、磷酸化JNK(p-JNK)及HSP70蛋白的檢測(cè) 離心收集各組細(xì)胞,將約 1× 106個(gè)細(xì)胞置于細(xì)胞裂解液中,在冰水浴中反復(fù)吹打進(jìn)行破碎,4℃、10 000 r/m in離心10 min,吸取上清液,即為細(xì)胞提取液。進(jìn)行總蛋白定量,調(diào)整蛋白濃度一致后,進(jìn)行SDS-PAGE電泳,然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,分別以鼠抗人 HSP70抗體、兔抗人JNK抗體和兔抗人p-JNK抗體為一抗,辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠或抗兔IgG為二抗,進(jìn)行Western Blot分析,化學(xué)發(fā)光法顯色后,應(yīng)用GeneTool圖像分析軟件進(jìn)行定量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。對(duì)各組細(xì)胞增殖率、p-JNK及HSP70蛋白的表達(dá)行析因設(shè)計(jì)的方差分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖率、p-JNK及HSP70蛋白的表達(dá)比較 見圖1、2,表1～3。

表1 各組細(xì)胞增殖率比較(n=3) %

表2 各組細(xì)胞p-JNK水平比較(n=3)

3 討論

由于實(shí)體瘤瘤體中心血供較周邊差,中心多為乏氧細(xì)胞,對(duì)化療和放療不敏感,而對(duì)熱較敏感;相反瘤體外周血供較中心血供好,外周細(xì)胞對(duì)化療較熱療敏感,因此,熱療結(jié)合化療能更有效地殺傷腫瘤細(xì)胞,同時(shí),熱化療聯(lián)合能增強(qiáng)化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用[5-6],逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥[7]。該研究結(jié)果顯示,熱療或化療單獨(dú)作用均可抑制細(xì)胞增殖,而熱化療聯(lián)合則有協(xié)同作用,與以上研究結(jié)果相符。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中主要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一,與細(xì)胞的增殖分化密切相關(guān)。其中JNK是MAPKs中的重要組成之一,在細(xì)胞應(yīng)激過程中被上級(jí)激酶MAPKKs磷酸化其Thr183和Tyr185 2個(gè)作用位點(diǎn)而被激活,并通過磷酸化以及功能性修飾它的分子靶標(biāo)來調(diào)控多種細(xì)胞的生理功能,尤其在細(xì)胞生長(zhǎng)增殖及凋亡方面有重要作用[8-9]。該研究中,熱療或化療單獨(dú)作用均可使p-JNK水平升高,而熱化療聯(lián)合則有協(xié)同作用,說明熱化療聯(lián)合對(duì)Raji細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用可能是通過 JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而發(fā)生的。

研究[10-12]顯示,加熱可以誘導(dǎo) HSPs表達(dá)增加,導(dǎo)致細(xì)胞熱耐受能力的提高。HSP70家族是HSPs中最保守和最主要的一類,在細(xì)胞應(yīng)激后生成最為顯著。該研究結(jié)果顯示,單純熱療或化療均使HSP70表達(dá)升高,而與單純熱療組相比,熱化療組HSP70表達(dá)降低,結(jié)合熱化療組細(xì)胞增殖率降低的結(jié)果,說明熱化療聯(lián)合的協(xié)同作用可能對(duì)抗了HSP70對(duì)腫瘤細(xì)胞的保護(hù)作用,從而更好地抑制了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。

綜上所述,熱化療聯(lián)合可抑制Raji細(xì)胞增殖,這種抑制作用可能是通過激活 JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路或部分抑制HSP70蛋白的表達(dá)來完成。

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