鄭利琴, 張慜＊, 孫金才, 丁占生,

(1.食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室江南大學(xué),江蘇無(wú)錫214122;2.浙江海通食品有限公司,浙江慈溪315300)

楊梅(Myrica rubra)是我國(guó)特產(chǎn)水果,主要分布在長(zhǎng)江以南的浙江和福建兩省,其中浙江楊梅現(xiàn)有栽培面積近100萬(wàn)畝,產(chǎn)量突破25萬(wàn)t。楊梅中含有豐富的碳水化合物、蛋白質(zhì)、氨基酸、有機(jī)酸、礦物質(zhì)、維生素和多酚類物質(zhì)[1]。楊梅多酚是楊梅中所含有的多酚類物質(zhì)的總稱,包括花色苷、黃酮醇、黃酮、沒(méi)食子酸、原兒茶酸等[2],其中花色苷、黃酮及沒(méi)食子酸屬于含量較多的多酚類物質(zhì)[3]。楊梅多酚的特點(diǎn)是此類化合物分子結(jié)構(gòu)中含有較多的酚羥基,具有較強(qiáng)的提供氫離子的作用,能清除活性氧自由基,具有抗氧化性,抗腫瘤,抑菌,抗血小板凝聚等作用[4-5]。

從天然產(chǎn)物中提取多酚類物質(zhì)的方法很多[6]。傳統(tǒng)提取多酚類化合物的方法為乙醇浸提法或水浸提法,所需的時(shí)間較長(zhǎng),而且容易達(dá)到飽和,導(dǎo)致工業(yè)化生產(chǎn)成本高。微波提取技術(shù)具有設(shè)備簡(jiǎn)單、適用范圍廣、提取效率高、重現(xiàn)性好、節(jié)省時(shí)間、節(jié)省試劑、污染小、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)[7];而超聲波萃取技術(shù)可以有效克服浸出時(shí)間長(zhǎng)、浸出溫度高、有效成分受熱過(guò)程長(zhǎng)、雜質(zhì)浸出多、能源消耗大等缺陷[8],從而提高植物多酚制取的經(jīng)濟(jì)效益。微波和超聲波萃取技術(shù)是當(dāng)前植物多酚最為常用的先進(jìn)提取工藝之一。

1 材料與方法

1.1 材料

荸薺種楊梅制成的冷凍楊梅原汁,此楊梅原汁為楊梅鮮果去核后榨汁所得,為100%楊梅原汁,出汁率為75%,由浙江海通食品集團(tuán)提供。

1.2 試劑

沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)購(gòu)于 Sigma公司;無(wú)水乙醇、無(wú)水碳酸鈉、Folin-酚、蘆丁,硝酸鋁,亞硝酸鈉,氫氧化鈉,檸檬酸鈉,鹽酸,醋酸鈉,冰醋酸等均為分析純。

1.3 儀器

752型紫外分光光度計(jì):上?？茖W(xué)精密儀器有限公司產(chǎn)品;TDL-60B離心機(jī):上海安亭科學(xué)有限公司產(chǎn)品;FA1104型電子天平:上海天平儀器廠產(chǎn)品;HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋:常州國(guó)華電器有限公司產(chǎn)品;MF-2270EG微波爐:青島海海爾波制品有限公司產(chǎn)品;J Y98-3D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī):寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品。

1.4 方法

將冷凍楊梅原汁于冰箱中5℃解凍,置于陰涼處備用。

1.4.1 楊梅多酚類物質(zhì)提取中提取劑的選擇 有機(jī)溶劑與水的復(fù)合體系作為提取劑最適合多酚類物質(zhì)的提取,有機(jī)溶劑的提取能力順序?yàn)?丙醇<乙醇<甲醇<丙酮<四氫呋喃。其中應(yīng)用最多的是丙酮-水體系,而丙酮-水體系中丙酮可引起其它物質(zhì)(如蛋白質(zhì)和多糖等)溶出量的增加,且超量丙酮吸入機(jī)體后會(huì)引起麻醉[9]。鑒于提取后的楊梅多酚用于制作食用產(chǎn)品,因此為防止提取物有機(jī)溶劑殘留過(guò)多并保證產(chǎn)品安全性,最終選擇乙醇-水體系作為提取劑。

1.4.2 楊梅原汁中多酚類物質(zhì)的提取 準(zhǔn)確量取5 mL的楊梅汁于100 mL的燒杯中,加入一定量的乙醇溶液,采用微波輔助浸提及超聲波輔助浸提兩種方法提取,將粗提液在轉(zhuǎn)速4 000 r/min下離心10 min,上清液作為待測(cè)液。

1.4.3 總酚含量的測(cè)定 總酚含量的測(cè)定,選用楊梅多酚粗提物中3種含量較高且具代表性的多酚類物質(zhì):花色苷,黃酮,及沒(méi)食子酸的測(cè)定,最后以這3種物質(zhì)的加和為當(dāng)量計(jì)算楊梅多酚提取物的量。

1)沒(méi)食子酸含量的測(cè)定 配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%飽和碳酸鈉溶液,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線Folin-酚法[10]:用5 mL的無(wú)水乙醇溶解0.250 0 g沒(méi)食子酸,定容至50 mL,分別移取 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.50、4.0 mL到50 mL容量瓶中,用水定容。這些溶液可以分別表示為質(zhì)量濃度為0,50,100,150,250,350,500 mg/L的沒(méi)食子酸溶液。從上述不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液中分別移取0.5 mL加入到50 mL容量瓶中,再分別加入30 mL的去離子水,混合;加入2.5mL的 Folin-酚試劑,搖勻后靜置 3～4 min;加入7.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的碳酸鈉溶液,混勻,定容。將上述標(biāo)準(zhǔn)溶液在25℃下放置2 h后,在765 nm下測(cè)定吸光值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。得到回歸線性方程為:

式中:Y1——吸光值;x1——沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度,mg/L;R2=0.9971,具有很好的線性關(guān)系。

2)黃酮含量的測(cè)定 精確稱取120℃干燥恒重蘆丁(作黃酮標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品)10 mg,體積分?jǐn)?shù)60%乙醇定容于100 mL容量瓶中,搖勻。分別移取蘆丁對(duì)照品溶液 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 、3.0、3.5、4.0 mL置10 mL具塞試管中,加質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%亞硝酸鈉溶液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%硝酸鋁溶液各0.3 mL,放置6 min;加1 mol/L的 NaOH溶液4.0 mL,用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液稀釋至刻度,搖勻。放置15 min,于510 nm處測(cè)吸光度[11],測(cè)得的吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。得到回歸線性方程為:

式中:Y2——吸光值;x2——蘆丁質(zhì)量濃度,mg/L;R2=0.9927,具有很好的線性關(guān)系。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid

3)花色苷含量的測(cè)定 取10 mL試管兩支,各加入0.5 mL果汁,再分別加入p H 1.0緩沖液和p H 4.5緩沖液各9.5 mL,置于暗處平衡30 min,以蒸餾水作對(duì)照,用紫外-可見(jiàn)分光光計(jì)在510 nm和700 nm處分別測(cè)定其吸光度值A(chǔ),每個(gè)樣品重復(fù)3次,取平均值,計(jì)算花色苷含量[12]:

總吸光度A=(A510-A700)pH1.0-(A510-A700)pH 4.5

花色苷含量x3(mg/L)=(A/(L×ε))×1 000×MW×稀釋倍數(shù)=(A/26 900)×1 000×449.2×稀釋倍數(shù)

其中:L為比色杯的寬度,大多數(shù)分光光度計(jì)比色杯的寬度為1 cm,即L值為1,ε為楊梅中的主要花色苷矢車菊3-葡萄糖苷的摩爾吸光系數(shù)26 900,MW為矢車菊3-葡萄糖苷的相對(duì)分子質(zhì)量449.2,稀釋倍數(shù)根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法中具體的倍數(shù)而定。

4)總酚含量的計(jì)算 楊梅汁中多酚含量的計(jì)算:X=x1+x2+x3;

樣品中總酚含量的計(jì)算:量取1.4.2中一定量離心好的上清液,按照各種酚類物質(zhì)測(cè)定方法,測(cè)定其吸光值,并計(jì)算楊梅汁中總酚含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對(duì)多酚類化合物提取的影響

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)楊梅多酚提取的影響 準(zhǔn)確量取5 mL的楊梅汁于100 mL的燒杯中,分別在微波功率為500 W、微波輻射時(shí)間30 s、液料比為4 mL∶1 g的條件,及超聲波功率500 W,超聲時(shí)間30 min,液料比為4 mL∶1 g的條件下,考察不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取量的影響,分別以沒(méi)食子酸,黃酮及花色苷為測(cè)定指標(biāo)。乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%,確定最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)。

在微波及超聲波兩種方法下,乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)楊梅多酚提取中主要酚類物質(zhì)提取的影響見(jiàn)圖2。從圖中可看出,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)增大時(shí),楊梅多酚類化合物提取的量也隨著提高,但超聲波提取乙醇體積分?jǐn)?shù)超過(guò)70%,微波提取乙醇體積分?jǐn)?shù)超過(guò)80%后,楊梅多酚提取的量有所下降。這與楊梅的組分以及多酚的物理性質(zhì)有關(guān),多酚易溶于乙醇,植物多酚與植物組織中的蛋白質(zhì)、生物堿、多糖等物質(zhì)發(fā)生復(fù)合。乙醇與水的混合液可打斷多酚類物質(zhì)與蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)的結(jié)合鍵,有利于多酚的提取。但乙醇濃度過(guò)高,會(huì)使楊梅汁中細(xì)胞失水而造成纖維間緊縮,影響多酚的滲出。此外,上圖可看出,采用超聲波提取得到的各個(gè)測(cè)定指標(biāo)的量均比微波提取的量大。因此以下實(shí)驗(yàn)中,超聲波提取均采用70%的乙醇溶液,微波提取均采用80%的乙醇體積分?jǐn)?shù)來(lái)提取楊梅多酚。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響Fig.2 Effect of alcohol concentration on the extraction capacity

2.1.2 提取功率對(duì)楊梅多酚提取的影響 準(zhǔn)確量取5 mL楊梅汁于100 mL的燒杯中,分別在乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%、微波輻射時(shí)間30 s、液料比為4 mL∶1 g的條件,及乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、超聲時(shí)間30 min、液料比為4 mL∶1 g的條件下,考察不同提取功率對(duì)提取量的影響,分別以沒(méi)食子酸,黃酮及花色苷為測(cè)定指標(biāo)。提取功率分別為 100、200、300、400、500、600 W,確定最佳的提取功率。

在微波及超聲波兩種方法下,微波及超聲波提取功率對(duì)楊梅多酚提取的影響見(jiàn)圖3。從圖中可看出,當(dāng)提取功率增大時(shí),楊梅多酚類化合物提取量的各個(gè)指標(biāo)也隨著提高,但微波及超聲功率超過(guò)500 W后,楊梅多酚提取的量有所下降。這主要是由于隨著提取功率的增加,物料在單位時(shí)間內(nèi)獲得的能量逐步增加,會(huì)加劇楊梅汁中組織細(xì)胞的破裂,使得多酚類物質(zhì)溶出,從而使提取量增加。但是當(dāng)微波功率增加時(shí),提取液溫度在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到上限值,甚至沸騰,乙醇沸點(diǎn)低,揮發(fā)較快,使得多酚類化合物有所損失。而超聲波提取時(shí)避免了提取液沸騰的現(xiàn)象。因此,從圖中曲線可看出,超聲波提取的多酚類物質(zhì)的量相較微波提取量較大,且微波及超聲波提取功率的最佳值均為500 W。因此,以下實(shí)驗(yàn)中提取功率均為500 W來(lái)提取楊梅多酚。

圖3 提取功率對(duì)提取率的影響Fig.3 Effect of power on the extraction capacity

2.1.3 處理時(shí)間對(duì)楊梅多酚提取的影響 準(zhǔn)確量取5 mL的楊梅汁于100 mL的燒杯中,分別在乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%、微波輻射功率為500 W、液料比為4 mL∶1 g的條件,及乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、超聲功率為500 W、液料比為4 mL∶1 g的條件下,考察不同提取時(shí)間對(duì)提取量的影響,分別以沒(méi)食子酸,黃酮及花色苷為測(cè)定指標(biāo)。微波提取時(shí)間為分別為 5、10、15、20、25、30、35、40 s,超聲波提取時(shí)間分別為 5、10、15、20、25、30、35、40 min。確定兩種提取方法最佳的提取時(shí)間。

在微波及超聲波兩種方法下,提取時(shí)間對(duì)楊梅多酚提取中主要酚類物質(zhì)提取的影響見(jiàn)圖4及圖5。從圖中可看出,當(dāng)提取時(shí)間增加時(shí),楊梅多酚類化合物提取量的各個(gè)指標(biāo)也隨著提高,但微波提取時(shí)間超過(guò)30 s,超聲提取時(shí)間超過(guò)35 min后,楊梅多酚提取的量有所下降。這主要是由于隨著提取時(shí)間的增加,有利于楊梅多酚提取物擴(kuò)散在溶劑中,增加了提取量。但提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng),會(huì)導(dǎo)致提取液溫度過(guò)高,使得多酚類物質(zhì)分解,減少提取量。因此,超聲波及微波提取時(shí)間均不宜過(guò)長(zhǎng)。從上圖得出超聲波最佳提取時(shí)間為35 min,微波最佳提取時(shí)間為30 s。通過(guò)曲線圖得出結(jié)論,以下實(shí)驗(yàn)中,超聲波提取時(shí)間為35 min,微波提取時(shí)間為30 s來(lái)提取楊梅中的多酚類物質(zhì)。

圖4 微波處理時(shí)間對(duì)提取量的影響Fig.4 Effect of microwave treatment time on the extraction capacity

圖5 超聲波處理時(shí)間對(duì)提取量的影響Fig.5 Effect of ultrasonic treatment time on the extraction capacity

2.1.4 液料體積質(zhì)量比對(duì)楊梅多酚提取的影響準(zhǔn)確量取5 mL的楊梅汁于100 mL的燒杯中,分別在乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%、微波輻射功率為500 W、微波提取時(shí)間為30 s的條件,及乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、超聲功率為500 W、超聲波提取時(shí)間為35 min的條件下,考察不同液料比對(duì)提取量的影響,分別以沒(méi)食子酸,黃酮及花色苷為測(cè)定指標(biāo)。兩種方法的液料比均為2 mL ∶1 g、3 mL ∶1 g、4 mL ∶1 g、5 mL∶1 g、6 mL∶1 g,確定最佳液料體積質(zhì)量比。

在微波及超聲波兩種方法下,提取液料體力體積質(zhì)量比對(duì)楊梅多酚提取中主要酚類物質(zhì)提取的影響見(jiàn)圖6。

從圖中可看出,隨著溶劑量的增大,楊梅多酚類化合物提取的量呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)?？紤]到如果溶劑量過(guò)少,雖然提取液中的各個(gè)指標(biāo)的測(cè)定含量高,但是提取物較少,而且可能會(huì)提取不完全;而溶劑量過(guò)大又增加了乙醇的用量,且提取率也有所下降。結(jié)合兩方面的原因,綜合考慮,微波及超聲波提取時(shí)采用液料體積質(zhì)量比4 mL∶1 g為宜。

圖6 液料體積質(zhì)量比對(duì)提取量的影響Fig.6 Effect of the ratio of material to liquid on the extraction capacity

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

2.2.1 微波輔助提取的正交實(shí)驗(yàn) 由于微波輔助浸提楊梅多酚的主要影響因素是受到乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波處理時(shí)間、微波處理功率、液料體積質(zhì)量比4個(gè)因素交叉影響,而以上所做的實(shí)驗(yàn)都是單因素的影響,為了全面考察這4個(gè)因素的影響,設(shè)計(jì)了4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)。選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波處理時(shí)間、微波處理功率、液料比為考察因素,選用L934正交表[13]對(duì)楊梅多酚提取工藝進(jìn)行研究,因素水平見(jiàn)表1。以提取液中沒(méi)食子酸、黃酮及花色苷代表性多酚類物質(zhì)的含量為考察指標(biāo),結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2及表3中的方差分析可知,四因素對(duì)楊梅總多酚提取效果的影響主次順序?yàn)?微波處理時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波處理功率、液料比。最優(yōu)水平組合式A2B2C1D2,即采用乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%,微波功率為500 W,微波處理時(shí)間為25 s,液料體積質(zhì)量比為4 mL/g。按照最佳提取工藝條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn),測(cè)得楊梅汁中總多酚含量為514.837 mg/L,大于正交實(shí)驗(yàn)中最大提取量。

表1 正交因素水平選擇表Tab.1 The level of orthogonal factors

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.2 The results of orthogonal experiment

表3 正交設(shè)計(jì)各因素方差分析表(完全隨機(jī)模型)Tab.3 Orthogonal factors analysis of variance(completely random model)

2.2.2 超聲波輔助提取的正交實(shí)驗(yàn) 由于超聲波輔助浸提楊梅多酚的主要影響因素是受到乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲波處理時(shí)間、超聲波處理功率、液料比4個(gè)因素交叉影響,而以上實(shí)驗(yàn)都是單因素的影響,為了全面考察這4個(gè)因素的影響,設(shè)計(jì)了4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)。選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲波處理時(shí)間、超聲波處理功率、液料比為考察因素,選用L934正交表[13]對(duì)楊梅多酚提取工藝進(jìn)行研究,因素水平見(jiàn)表3。以提取液中沒(méi)食子酸、黃酮及花色苷代表性多酚類物質(zhì)的含量為考察指標(biāo),結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 正交因素水平選擇表Tab.4 Level of orthogonal factors

表5 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.5 Results of orthogonal experiment

表6 正交設(shè)計(jì)各因素方差分析表(完全隨機(jī)模型)Tab.6 Orthogonal factors analysis of variance(completely random model)

由表4及表5可知,四因素對(duì)楊梅總多酚提取效果的影響主次順序?yàn)?液料體積質(zhì)量比、超聲波處理時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲波處理功率。最優(yōu)水平組合式A1B2C2D2,即采用乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%,超聲波功率為500 W,超聲波處理時(shí)間為35 min,液料體積質(zhì)量比為4 mL/g。按照最佳提取工藝條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn),測(cè)得楊梅汁中總多酚含量為609.256 mg/L,大于正交實(shí)驗(yàn)中最大提取量。

3 結(jié) 語(yǔ)

研究了采用超聲波及微波輔助提取兩種方法提取楊梅汁中的多酚類物質(zhì),以沒(méi)食子酸、黃酮、花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)3個(gè)測(cè)定指標(biāo)來(lái)比較這兩種方法的優(yōu)劣。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,微波提取的主要缺點(diǎn)是隨著微波提取的進(jìn)行,會(huì)導(dǎo)致提取液溫度過(guò)高,使得多酚類物質(zhì)分解,減少提取量,且微波處理后提取液體積變小,多酚類化合物所占體積分?jǐn)?shù)較大,但總的提取量較處理前反而下降,而利用超聲波輔助浸提則可避免這一缺點(diǎn),與微波輔助提取相比,超聲波耗時(shí)很長(zhǎng)。利用微波輔助提取方法處理時(shí)間大幅度減少,微波處理時(shí)間較短,可節(jié)省大量的生產(chǎn)時(shí)間。

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