丁保淼, 張曉鳴＊1,, 夏書芹

(1.食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江南大學(xué),江蘇無(wú)錫 214122;2.江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇無(wú)錫214122)

鐵是血液不可缺少的重要組分,許多生命活動(dòng)都需要鐵的參與。人體所需要的鐵主要來(lái)源于食物。據(jù)報(bào)道,目前世界上有20%人口的患有缺鐵癥狀[1],我國(guó)缺鐵性貧血同樣高達(dá)15%～20%,全國(guó)約有2億人患有缺鐵性貧血和鐵營(yíng)養(yǎng)不良癥,其中婦女和青少年兒童最為嚴(yán)重。對(duì)食物進(jìn)行鐵強(qiáng)化被認(rèn)為是最為有效地預(yù)防和治療缺鐵性貧血和鐵營(yíng)養(yǎng)不良的方法[2]。

與常用的鐵強(qiáng)化劑如硫酸亞鐵相比,甘氨酸螯合鐵有更有效的生物利用率、更好的穩(wěn)定性、更高的安全性等[3]。但它對(duì)胃液的強(qiáng)酸環(huán)境過于敏感,易于在此環(huán)境下發(fā)生解離[4]。脂質(zhì)體技術(shù)[5]是一種特殊的微膠囊技術(shù),可將敏感成分保護(hù)起來(lái),使其免受外界環(huán)境,如酸堿性、溫度、氧氣、光線等因素的影響,已經(jīng)在醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域展開了廣泛地研究[6-8]。

雖然牛乳被公認(rèn)為是一種比較理想的完全食品,但其鐵含量較低,僅為0.01～0.1 mg/dL,因此在牛乳中強(qiáng)化鐵,不僅能提高產(chǎn)品的檔次,也是拓展市場(chǎng)的一個(gè)重要內(nèi)容,更是改變我國(guó)人民缺鐵性貧血的一種經(jīng)濟(jì)方便、直接有效的理想途徑[9]。

本實(shí)驗(yàn)以甘氨酸螯合鐵為芯材,蛋黃卵磷脂為主要壁材,采用反相蒸發(fā)法制備出甘氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體;研究以甘氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體為強(qiáng)化鐵源強(qiáng)化牛奶時(shí)對(duì)奶體系的氧化穩(wěn)定性和感官性質(zhì)的影響,并與硫酸亞鐵和甘氨酸螯合鐵進(jìn)行比較,旨在為預(yù)防和治療缺鐵性貧血開發(fā)新型鐵強(qiáng)化劑,并為其實(shí)際應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

蛋黃卵磷脂:華東師范大學(xué)化工廠生產(chǎn),生物級(jí);膽固醇、硫酸亞鐵,均為分析純;吐溫 80:化學(xué)純:國(guó)藥集團(tuán)生產(chǎn)。甘氨酸螯合鐵根據(jù)文獻(xiàn)[10]制備。光明鮮牛奶(全脂巴氏殺菌乳):光明乳業(yè)股份有限公司生產(chǎn),脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥3.2%,蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥3.0%,非脂乳固體質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥8.1%,非強(qiáng)化奶。其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器:上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn);VCX400細(xì)胞破碎超聲儀:Sonics&Material Inc.生產(chǎn);HITACHI H-600型透射電子顯微鏡:日本日立株式會(huì)社生產(chǎn);Nano-ZS90型粒徑電位測(cè)定儀:英國(guó)Malvern儀器有限公司產(chǎn)品;UV-1600分光光度計(jì):上海美譜達(dá)儀器有限公司生產(chǎn);WSC-S測(cè)色色差計(jì):上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 甘氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體的制備及表征

采用反相蒸發(fā)法[11]制備納米脂質(zhì)體。稱取一定量的蛋黃卵磷脂和膽固醇溶于無(wú)水乙醚,得有機(jī)相。稱取一定量的甘氨酸螯合鐵溶解于去離子水中,得水相。將有機(jī)相和水相混合,并在冰水浴中超聲,直到得到均一的w/o型乳狀液。把w/o型乳狀液移入圓底燒瓶中,于40℃水浴中進(jìn)行減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。約5～10 min,在燒瓶?jī)?nèi)壁上形成了凝膠狀物,繼續(xù)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),凝膠狀物塌陷,形成水混懸液的脂質(zhì)體體系。然后加入適量的吐溫80PBS緩沖液,繼續(xù)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)30 min,充分水合除去殘留的乙醚。再用氮?dú)鈱堄嘁颐汛党Ｗ詈髮?duì)得到的脂質(zhì)體混懸液于冰浴中進(jìn)行超聲,以降低脂質(zhì)體的粒徑,得到的即為納米脂質(zhì)體。將最終產(chǎn)品置于4℃冰箱中保存。

1.4 甘氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體的形態(tài)表征和粒徑分布

將1滴納米脂質(zhì)體懸浮液分散在銅網(wǎng)上,2～3 min后,用濾紙吸去多余的樣品;用體積分?jǐn)?shù)2%的磷鎢酸水溶液對(duì)樣品進(jìn)行染色。用透射電子顯微鏡(TEM)于75 kV電壓下觀察負(fù)染得納米脂質(zhì)體樣品。

根據(jù)動(dòng)態(tài)激光光散射技術(shù),于25℃下用粒徑測(cè)定儀測(cè)定納米脂質(zhì)體的粒徑。納米脂質(zhì)體的磷脂濃度用0.05 mol/L p H 7.0的PBS緩沖液稀釋至體積分?jǐn)?shù)0.1%。

1.5 鐵強(qiáng)化牛奶

1.5.1 鐵強(qiáng)化牛奶的制備 根據(jù)我國(guó)《食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB14880-94)添加鐵強(qiáng)化劑的量。取800 mL光明鮮牛奶(非強(qiáng)化奶)煮沸1 min,均分為4份,每份200 mL,自然冷卻至室溫;按20 mg/kg的鐵元素添加量,在1號(hào)樣中加入相當(dāng)于4 mg鐵的甘氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體懸浮液,2號(hào)樣中加入相當(dāng)于4 mg鐵的甘氨酸螯合鐵,3號(hào)樣中加入相當(dāng)于4 mg鐵的硫酸亞鐵,4號(hào)樣為空白。并加入0.03%的脫氫乙酸鈉作為防腐劑。充分?jǐn)嚢琛⒒旌暇鶆?。將每份樣品再均分?份,每份40 mL。殺菌,密封。置于4℃冰箱冷藏,定期對(duì)強(qiáng)化奶進(jìn)行分析。

1.5.2 牛奶中鐵含量的測(cè)定 取10 mL牛奶于瓷坩堝,在電爐上干燥、揮發(fā)、碳化后,移入馬弗爐,于550℃灰化5 h。將得到的樣品灰分于25 mL容量瓶中定容。用鄰啡啰啉比色法[12]測(cè)定鐵含量。

1.5.3 牛奶中脂質(zhì)成分氧化的測(cè)定 采用硫代巴比妥酸(TBA)法[13]測(cè)定牛奶中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量,以評(píng)估牛奶中脂質(zhì)成分的氧化程度。取三氯乙酸(TCA)37.5 g、TBA 0.925、濃 HCl 5.25 g溶于去離子水,于80℃水浴不斷攪拌使其充分溶解,冷卻后用去離子水定容至250 mL,得TBA-TCA-HCl溶液,過濾備用。

取3 mL牛奶于10 mL刻度試管,加入6 mL TBA-TCA-HCl溶液,混合均勻,然后將樣品試管置于沸水浴,加熱30 min后,用冰浴迅速冷卻之,再用 TBA-TCA-HCl溶液將樣品定容至10 mL,漩渦振蕩,混合均勻。于2 500 r/min離心5 min,過濾,以 TBA-TCA-HCl溶液為空白,于532 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)532nm,并由下式計(jì)算MDA值。

其中,4.15為每毫升含丙二醛量的換算系數(shù)。

1.5.4 牛奶色澤的測(cè)定 用WSC-S測(cè)色色差計(jì)對(duì)牛奶的色澤進(jìn)行測(cè)定,選用指標(biāo)L、a、b和ΔL、Δa、Δb、ΔE進(jìn)行評(píng)價(jià)。其中,L為樣品亮度,該值越大,樣品越亮;a為樣品有紅綠色偏向程度,正值越大,偏向紅色程度越大,負(fù)值越大,偏向綠色的程度越大;b為樣品黃藍(lán)色偏向程度,正值越大,偏向黃色程度越大,負(fù)值越大,偏向藍(lán)色的程度越大;ΔL為樣品與參比樣之間的亮度差,正值為樣品更亮,負(fù)值為樣品更暗;Δa為樣品與參比樣之間的紅綠色差;Δb為樣品與參比樣之間的黃藍(lán)色差;ΔE為樣品與參比樣之間的總色差,其計(jì)算公式為

1.5.5 牛奶體系粘度的測(cè)定 取一定體積牛奶移入烏氏粘度計(jì),并將粘度計(jì)置于30℃水浴中,預(yù)熱15 min,測(cè)定牛奶的粘度。以去離子水做空白。

1.5.6 牛奶體系濁度穩(wěn)定性的測(cè)定 取一定體積牛奶于離心管,以2 500 r/min離心15 min,取上清液1 mL,稀釋20倍至20 mL,于600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定離心后所得牛奶上清液的吸光度Aa,并同時(shí)測(cè)定離心前的吸光度Ab前,其比值即為牛奶的穩(wěn)定系數(shù)R,即R=Aa/Ab。

2 結(jié)果與討論

2.1 甘氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體的形態(tài)和粒徑分布

制備出的甘氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體具有淺黃色的外觀。甘氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體的 TEM圖顯示,甘氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體呈球形微粒,具有均勻的粒徑分布和光滑的表面(見圖1)。粒徑測(cè)定結(jié)果顯示,甘氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體的平均粒徑為84.61 nm,多分散指數(shù)為0.159(見圖2)。

圖1 甘氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體的TEM圖Fig.1 TEM micrographs of ferrous glycinate nonoliposomes

圖2 甘氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體的粒徑分布Fig.2 Sizes distribution of ferrous glycinate nanoliposomes

2.2 牛奶強(qiáng)化前后的總鐵含量

實(shí)測(cè)牛奶強(qiáng)化前后的鐵含量如圖3所示。測(cè)定出的強(qiáng)化奶中的鐵含量與計(jì)算加入的鐵量略有出入,這可能是牛奶強(qiáng)化前后強(qiáng)化鐵源回收率的差異造成的。

圖3 鐵強(qiáng)化前后牛奶中的總鐵含量Fig.3 Amount of total iron in milk before and after iron fortification

2.3 貯藏期間的牛奶中脂質(zhì)成分的氧化

通常采用TBA法評(píng)價(jià)脂質(zhì)的氧化程度。不飽和脂肪酸氧化分解,產(chǎn)生的衍生物如丙二醛與 TBA反應(yīng)顯色后,于532 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。吸光值越小,則脂肪氧化產(chǎn)物越少;吸光值越大,則脂肪氧化產(chǎn)物越多。這種方法相對(duì)較為簡(jiǎn)單,且一般與感官分析的結(jié)果有很好的相關(guān)性,因而是廣為使用的評(píng)價(jià)脂質(zhì)氧化程度的指標(biāo)之一。

在貯藏4周的時(shí)間內(nèi),鐵強(qiáng)化對(duì)牛奶中脂質(zhì)氧化的影響見圖4。

圖4 鐵強(qiáng)化對(duì)牛奶中脂質(zhì)成分氧化的影響Fig.4 Effect of iron sources on lipid oxidation in fortified milk

由圖4可見,在樣品貯藏期間,隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),4個(gè)樣品中丙二醛含量是先上升后下降的。這是因?yàn)?隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),樣品中脂質(zhì)成分氧化程度增加,導(dǎo)致了脂質(zhì)氧化產(chǎn)物丙二醛含量的上升;而貯藏后期樣品中丙二醛含量的有所下降,這可能是因?yàn)橹|(zhì)氧化產(chǎn)物丙二醛與牛奶中具有反應(yīng)活性的氨基相互作用生成了1-氨基-3-氨基丙烯,而降低了丙二醛含量[14]。在貯藏期間,空白牛奶中的脂質(zhì)成分最為穩(wěn)定,氧化程度最低;與空白牛奶相比,3種鐵強(qiáng)化奶中的脂質(zhì)成分氧化程度較大,這可能是因?yàn)殍F強(qiáng)化劑的金屬離子會(huì)加速脂質(zhì)的氧化[15]。在3種強(qiáng)化奶中,雖然硫酸亞鐵強(qiáng)化奶中的鐵元素含量最低(見圖3),但 FeSO4強(qiáng)化奶中脂質(zhì)氧化最為嚴(yán)重,甘氨酸螯合鐵強(qiáng)化奶次之,甘氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體強(qiáng)化奶最低。這可能是因?yàn)镕eSO4為無(wú)機(jī)鹽,在強(qiáng)化奶中以 Fe2+形式存在,而Fe2+會(huì)催化氧化奶中脂質(zhì)成分;而甘氨酸螯合鐵以螯合的形式存在,這大大地限制了鐵離子對(duì)奶中脂質(zhì)成分的催化氧化作用[3];在甘氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)強(qiáng)化奶中,由于甘氨酸螯合鐵被包封在脂質(zhì)體的內(nèi)水相中,卵磷脂雙分子層將甘氨酸螯合鐵和奶中的脂質(zhì)成分隔開,避免了它們的相互接觸[8],因此抑制了鐵源對(duì)奶中脂質(zhì)成分的催化氧化。

2.4 牛奶色澤的變化

色澤是牛奶的一個(gè)重要物理參數(shù)。用色差計(jì)測(cè)定鐵強(qiáng)化前后牛奶的色澤見圖5。

圖5 鐵強(qiáng)化前后牛奶的色澤變化Fig.5 Change of color and luster of milk before andafter iron fortification

由圖5可見,對(duì)空白牛奶和不同鐵源的強(qiáng)化奶,其亮度并沒有明顯變化。這可能是由于加入的鐵強(qiáng)化劑量較少,并不足以改變奶體系的亮度。a、b值顯示,鐵強(qiáng)化后,奶體系的綠色和黃色有所增加。硫酸亞鐵強(qiáng)化奶的綠色趨勢(shì)有所增加,這可能是因?yàn)榱蛩醽嗚F為無(wú)機(jī)二價(jià)鐵鹽,其本身具有綠色,因而增加了奶體系的綠色。甘氨酸螯合鐵強(qiáng)化奶和甘氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體強(qiáng)化奶的黃色趨勢(shì)有所增加,可能是由于甘氨酸螯合鐵自身的顏色和甘氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體的壁材蛋黃卵磷脂本身具有淡黃色所致。從數(shù)據(jù)看,3種鐵強(qiáng)化劑對(duì)奶體系紅綠色度和黃藍(lán)色度的絕對(duì)程度改變并不大。

貯藏期間空白奶和強(qiáng)化奶的色澤隨時(shí)間的變化情況見圖6。

圖6 在貯藏期間空白奶和強(qiáng)化奶色澤的變化:(a)為光強(qiáng)度的變化;(b)為紅綠色度 a值的變化;(c)為黃藍(lán)色度 b值的變化;(d)為總色差ΔE的變化Fig.6 Change of color and luster of unfortifiedandfortified milk in storage period:(a)visual lightness;(b)redness-to-greeness;(c)yellowness-toblueness;(d)total color difference

由圖6可見,空白奶和強(qiáng)化奶的亮度均隨貯藏時(shí)間的增加而下降。這可能是因?yàn)槟腆w系中由聚集、絮凝以及一些成分的變化引起的。與硫酸亞鐵和甘氨酸螯合鐵相比,雖然甘氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體強(qiáng)化后對(duì)奶的總色差改變最大,但在貯藏期間,甘氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體強(qiáng)化奶的色澤很穩(wěn)定,變化很小。而硫酸亞鐵和甘氨酸螯合鐵強(qiáng)化后對(duì)奶的總色差改變較小,但隨著貯藏時(shí)間的增加,色澤變化很大,在貯藏結(jié)束時(shí),色澤的改變明顯大于甘氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體強(qiáng)化奶的總色差。這可能是因?yàn)楦拾彼狎翔F納米脂質(zhì)更為穩(wěn)定,與奶體系中的其他組分作用更小,因而維護(hù)了奶的色澤。

2.5 牛奶粘度的變化

粘度是牛奶的一個(gè)重要物理性質(zhì)。在乳狀液體系中,體系的粘度對(duì)其穩(wěn)定性有重要的意義,粘度高可以限制乳狀液粒子在重力作用下的下沉,易于體系的穩(wěn)定性[16]。在貯藏期間,空白奶和強(qiáng)化奶粘度的變化如圖7所示。

圖7 在貯藏期間空白奶和強(qiáng)化奶粘度的變化Fig.7 Change of viscosity of unfortified and fortified milk in storage period

由圖7可見,空白牛奶和強(qiáng)化牛奶的粘度差別不大。在貯藏前期,牛奶粘度是穩(wěn)定的;在貯藏后期,牛奶的粘度明顯下降,這可能是由于牛奶內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)的變化引起的,如乳凝塊和乳清的分層,導(dǎo)致了粘度的變小[17]。

2.6 牛奶體系的濁度穩(wěn)定性

通常用牛奶離心前后上清液吸光度的比值R(即穩(wěn)定系數(shù))來(lái)評(píng)價(jià)牛奶體系的穩(wěn)定性。在貯藏期間,空白奶和強(qiáng)化奶的穩(wěn)定系數(shù)R見表1。

表1 空白奶和強(qiáng)化奶的穩(wěn)定系數(shù)R在貯藏期間的變化Tab.1 Change of stability coefficient R of unfortified and fortified milk in storage period

從表1可以看出,在貯藏前期,4個(gè)樣品均是穩(wěn)定的;從第3周開始,空白奶、硫酸亞鐵強(qiáng)化奶和甘氨酸螯合鐵強(qiáng)化奶開始失穩(wěn)。貯藏期間,樣品總的穩(wěn)定順序是Lip-FeAA強(qiáng)化奶>FeAA強(qiáng)化奶>空白>FeSO4強(qiáng)化奶。

3 結(jié) 語(yǔ)

以蛋黃卵磷脂為主要壁材通過反向蒸發(fā)法制備出了具有球形形態(tài)和粒徑分布均勻的甘氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體。以甘氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體為強(qiáng)化鐵源強(qiáng)化牛奶的貯藏結(jié)果表明,與硫酸亞鐵和甘氨酸螯合鐵相比,由于甘氨酸螯合鐵被包封在了脂質(zhì)體的內(nèi)水相中,卵磷脂雙分子層隔開了甘氨酸螯合鐵與奶中其他組分的直接接觸,因而降低了它對(duì)奶中的脂質(zhì)成分的催化氧化作用,增加了強(qiáng)化奶在貯藏期間的氧化穩(wěn)定性和維護(hù)了強(qiáng)化奶的感官質(zhì)量。因此,甘氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體可能是一種在預(yù)防和治療缺鐵癥狀方面有應(yīng)用潛力的鐵強(qiáng)化劑。

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