肖可為,辛?xí)苑?劉雪梅,何宏偉

支氣管哮喘(哮喘)為慢性氣道炎癥性疾病,氣道炎癥導(dǎo)致氣道的重塑。正常情況下細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)處于合成與降解的動(dòng)態(tài)平衡之中?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMP)是由20多種鋅、鈣離子依賴性蛋白內(nèi)切酶所組成,能降解所有ECM蛋白成分。在炎癥狀態(tài)下炎性細(xì)胞和結(jié)構(gòu)細(xì)胞表達(dá)MMP明顯增強(qiáng)?；|(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)抑制MMP的活化,促進(jìn)ECM沉積和抑制其降解。目前認(rèn)為MMP/TIMP失衡可能是ECM合成增多、降解減少的主要原因。支氣管哮喘上皮下膠原的大量沉積是氣流受限的重要原因[1]。我們的研究主要探討哮喘患者誘導(dǎo)痰中MMP-9和TIMP-1水平的變化是否與氣道炎癥和氣道受限有關(guān)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 哮喘組:緩解期哮喘患者16例,男10例,女6例,平均年齡(46±10)歲。診斷符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)2003年的哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]。哮喘病程10 ～30年。所有哮喘患者均不吸煙,近1個(gè)月內(nèi)無(wú)哮喘嚴(yán)重發(fā)作,近2個(gè)月內(nèi)未吸入糖皮質(zhì)激素(簡(jiǎn)稱激素)或口服激素。茶堿在進(jìn)入本研究前至少已停用48 h。健康對(duì)照組:12名,男9名,女3名,平均年齡(48±9)歲,均為門診體檢的健康志愿者,無(wú)呼吸道疾病史,近1個(gè)月內(nèi)無(wú)呼吸道感染,均不吸煙,肺功能在正常范圍內(nèi)。

1.2 方法

1.2.1 痰液誘導(dǎo)和處理 患者早晨禁食,痰誘導(dǎo)前所有受試者均行第一秒用力呼氣容積 (FEV1)、FEV1/FVC(用力肺活量)檢查,然后吸入沙丁胺醇200 μg,10 min后通過(guò)壓縮霧化吸入裝置(BOY 037,德國(guó)百瑞公司)噴射霧化吸入3%氯化鈉溶液20 min。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中鼓勵(lì)患者咳嗽,間斷中止吸入氯化鈉液以便咳出痰液至50 m l無(wú)菌瓶中。若在上述過(guò)程中受試者出現(xiàn)喘息、嚴(yán)重咳嗽或呼吸困難,或FEV1下降＞20%則隨時(shí)停止痰液誘導(dǎo)。排痰前用生理鹽水沖洗口腔,以減少唾液對(duì)痰液的污染。

確定所收集的痰液標(biāo)本的體積,加入2倍體積的0.1%二硫蘇糖醇(DTT)。然后輕輕將標(biāo)本搖勻,放在37℃的水浴中孵育30 min,震蕩15 min以便充分均勻,取少許(約50 μl)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。再加等體積的磷酸鹽緩沖液(PPS)混勻,以800 r/min(離心半徑15 cm)離心15 min,從細(xì)胞團(tuán)中分離出上清液。將細(xì)胞團(tuán)涂片,以瑞氏染色加等量PPS緩沖液3 ～5 min。用清水沖凈晾干后鏡檢,光鏡下分類計(jì)數(shù)。在油鏡下每張涂片共計(jì)數(shù)400個(gè)非鱗狀上皮細(xì)胞并進(jìn)行炎性細(xì)胞的分類計(jì)數(shù)。吸出上清液以2000 r/min(離心半徑15 cm)離心10 min后,棄沉淀留取上清液并冷凍于-20℃待檢。

1.2.2 誘導(dǎo)痰上清液中IL-4、MMP-9、TIMP-1濃度測(cè)定 用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)對(duì)誘導(dǎo)痰上清液中的IL-4、MMP-9、TIMP-1 濃度進(jìn)行檢測(cè)。IL-4試劑盒為深圳炬英公司進(jìn)口分裝 (批號(hào):H0061801), MMP-9 和 TIMP-1 試劑盒購(gòu)自美國(guó)R＆D公司(批號(hào)分別為209622、231949),按照試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示,行配對(duì)t檢驗(yàn),P＜0.05則表示組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;用直線相關(guān)性分析兩變量間的相關(guān)關(guān)系。

2 結(jié) 果

2.1 兩組受試者肺功能測(cè)定和誘導(dǎo)痰中細(xì)胞總數(shù)、分類計(jì)數(shù)比較 見(jiàn)表1、表2。

表1 兩組受試者肺功能比較±s)

表1 兩組受試者肺功能比較±s)

注:與對(duì)照組比較, a P＜0.05

組別 例數(shù) 平均(歲年)齡預(yù)F計(jì)E值V1 (占%)FEV(%1/F)VC哮喘組 16 46±10 68±10a 71±9a對(duì)照組 12 48±9 96±15 82±6

表2 兩組受試者誘導(dǎo)痰中細(xì)胞總數(shù)、分類計(jì)數(shù)比較±s)

表2 兩組受試者誘導(dǎo)痰中細(xì)胞總數(shù)、分類計(jì)數(shù)比較±s)

注:與對(duì)照組比較, a P＜0.05

組別 例數(shù) 細(xì)×胞1總08/數(shù)L巨噬細(xì)胞 中性粒細(xì)細(xì)胞胞 分類(%嗜)酸粒細(xì)胞 淋巴細(xì)胞哮喘組 16 5.6±2.3 44.0±8.0 30.0±6.0 18.3±6.7a 8.0±5.0對(duì)照組 12 3.5±1.1 65.0±11.0 27.0±6.0 0.8±0.5 7.0±4.0

2.2 兩組受試者誘導(dǎo)痰中MMP-9和TIMP-1濃度變化及其與肺功能關(guān)系 哮喘組誘導(dǎo)痰中MMP-9和 TIMP-1濃度與健康對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)表 3)。其比值哮喘組與健康對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),且與FEV1占預(yù)計(jì)值呈正相關(guān)(r分別為 0.55、0.62,P均 ＜0.05)。

表3 兩組受試者誘導(dǎo)痰中MMP-9和TIMP-1濃度比較±s)

表3 兩組受試者誘導(dǎo)痰中MMP-9和TIMP-1濃度比較±s)

注:與對(duì)照組比較, a P＜0.05

組別 例數(shù) MMP-9(g/L)TIMP-1(g/L)MMP-9/TIMP-1哮喘組 16 15.8±6.0a 19.7±8.5a 0.9±0.7a對(duì)照組 12 1.9±1.2 1.3±0.8 1.6±0.5

3 討 論

巨噬細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞是MMP-9 的主要來(lái)源, 作為MMP-9 特異性抑制物的TIMP-1, 也常由分泌 MMP-9 的炎癥細(xì)胞分泌。本研究結(jié)果表明, 與健康對(duì)照組比較,未經(jīng)治療的哮喘患者誘導(dǎo)痰中MMP-9 和TIMP-1水平明顯增加, 同時(shí)誘導(dǎo)痰中嗜酸粒細(xì)胞數(shù)也增加明顯。研究表明, 哮喘患者誘導(dǎo)痰中增高的MMP-9濃度與嗜酸粒細(xì)胞數(shù)相關(guān), 提示在哮喘患者嗜酸粒細(xì)胞是MMP-9的主要來(lái)源;也有研究資料顯示MMP-9還可促進(jìn)哮喘患者嗜酸粒細(xì)胞的浸潤(rùn)[3]。

氣道重塑是機(jī)體對(duì)氣道炎癥損傷過(guò)程中的一種修復(fù)反應(yīng),但修復(fù)后的組織結(jié)構(gòu)和功能均與正常組織不同。哮喘患者氣道重塑時(shí)的結(jié)構(gòu)變化主要是以ECM重塑為特征,不同于慢性阻塞性肺疾病(COPD)是由于膠原沉積,導(dǎo)致氣道壁的增厚加劇氣道的狹窄,對(duì)氣流受限的功能性變化產(chǎn)生重要影響[4]。哮喘時(shí)膠原的沉積主要局限在上皮基底膜下,形成富含纖維膠原的致密層,在氣道壁的過(guò)度沉積[1],從而形成氣道重塑,進(jìn)而導(dǎo)致肺功能下降。

此外,本組資料顯示:哮喘患者中TIMP-1濃度和MMP-9/TIMP-1比值與氣流受限間的相關(guān)性,提示MMP-9/TIMP-1間的失平衡對(duì)氣流受限產(chǎn)生重要作用,且可能是由于膠原的沉積和氣道壁的增厚所致。有研究資料表明,哮喘和 COPD患者痰液中MMP-9和TIMP-1間的失平衡與在高分辨率CT掃描下所測(cè)得的氣管壁結(jié)構(gòu)的改變有關(guān)[5]。這進(jìn)一步說(shuō)明了MMP-9和TIMP-1間的失平衡與氣道重塑的關(guān)系。對(duì)于MMP-9 和TIMP-1與氣流受限的關(guān)系,從目前的研究結(jié)果來(lái)看各有所不同。對(duì)經(jīng)過(guò)變應(yīng)原刺激后6 h哮喘患者測(cè)定肺功能與誘導(dǎo)痰中MMP-9和TIMP-1水平,發(fā)現(xiàn)MMP-9 與FEV1呈負(fù)相關(guān)[6]。Bosse等[7]和Bergeron等[8]發(fā)現(xiàn)哮喘患者血清中MMP-9/TIMP-1比值與口服激素后FEV1變異值呈正相關(guān),但TIMP-1水平與FEV1變異值無(wú)相關(guān)性。本研究結(jié)果與其他研究結(jié)果的不相一致,可能與受試者病情存在差異及MMP-9和TIMP-1的來(lái)源、測(cè)定時(shí)間不同有關(guān)。

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