郭秀芳

高溫高壓抗原修復(fù)法提高乳腺癌免疫組化準(zhǔn)確率的應(yīng)用研究

郭秀芳

目的 探討免疫組化反應(yīng)中的高溫高壓抗原修復(fù)法預(yù)處理方法對(duì)反應(yīng)結(jié)果的影響。方法對(duì) 60份經(jīng)10%中性甲醛液固定過的乳腺癌組織,經(jīng)脫水、石蠟包埋制成切片,分別采用高溫高壓抗原修復(fù)法和微波爐抗原修復(fù)法做預(yù)處理后,進(jìn)行免疫組化染色。結(jié)果 石蠟組織切片免疫組化反應(yīng)預(yù)處理,采用高溫高壓抗原修復(fù)法,其陽性率為 55.8%,采用微波爐抗原修復(fù)法,其陽性率為 45.4%。免疫組化反應(yīng)中采用高壓高溫抗原修復(fù)法作預(yù)處理,石蠟組織切片陽性表達(dá)率較微波爐抗原修復(fù)法明顯提高(P＜0.05)。結(jié)論 預(yù)處理采用高溫高壓抗原修復(fù)法,提高了免疫組化陽性率的表達(dá),顯色對(duì)比鮮明,背景干凈清晰,從而提高病理診斷的準(zhǔn)確率。

高溫高壓抗原修復(fù)法;免疫組織化學(xué)技術(shù);組織預(yù)處理

免疫組化已成為現(xiàn)代病理診斷中不可缺少的檢測(cè)技術(shù),特別是在判斷腫瘤組織的來源、分類以及良惡性腫瘤的鑒別診斷等方面起著重要作用[1],但是免疫組化的不穩(wěn)定性常常困擾著免疫組化的工作人員,送檢組織經(jīng)過甲醛固定抗原決定簇被醛基交聯(lián)封閉,無法有效地與抗體結(jié)合而顯示出來,從而大大影響了免疫組化的結(jié)果[2],為提高標(biāo)本中抗原檢測(cè)陽性率,我科從 2004年應(yīng)用高溫高壓抗原修復(fù)法,用PBS抗原修復(fù)液對(duì)乳腺癌的組織切片的雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、P53、Ki67進(jìn)行檢測(cè),方法介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料 本科室近期已確認(rèn)乳腺癌 60份組織塊,切片厚度3μm。試劑：第一抗體為兔抗人 ER單克隆抗體,兔抗人 PR單克隆抗體,兔抗人P53單克隆抗體,兔抗人 Ki67單克隆抗體。第二抗體為快捷免疫組化 Maxvision TM檢測(cè)試劑盒,即用型單克隆抗兔 KIT5006(均購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司,直接使用,無需稀釋),新鮮配制的 pH值為 7.4的PBS液為緩沖液。儀器：醫(yī)用可調(diào)控電爐 2 000 kW,市售不銹鋼高壓鍋直徑 16 cm,750W National微波爐 1臺(tái)。

1.2 方法 (1)前期準(zhǔn)備：包括組織即時(shí)充分固定,合理取材,適宜的石蠟包埋,薄而完整均勻的切片,用經(jīng)過APES防脫片劑處理過的載玻片撈出平整而無氣泡的組織片進(jìn)行免疫組化染色;(2)烘片：在 58～60℃恒溫箱中烘片 2～4 h;(3)切片常規(guī)脫蠟,梯度乙醇、蒸餾水洗;(4)3%H2O2溶液浸泡 5～10 min,以抵制內(nèi)源性過氧化物酶,蒸餾水洗 3次,每次 2min;(5)切片置于盛有 PBS緩沖液的高壓鍋或微波爐中;前者,高壓鍋內(nèi)盛PBS液放于電爐上,燒至 95℃(有小氣泡連續(xù)上冒)把盛有組織切片的立式染色架平放于 PBS液中(這樣可節(jié)省 PBS液)使PBS液浸沒染色架,蓋上鍋蓋,待鍋內(nèi)水沸騰至高壓鍋蓋頂?shù)某鰵饪趪姎夂蠹纯蛇_(dá)到工作溫度和工作壓力,持續(xù) 2min移開火源,待高壓鍋內(nèi)氣泄放完后打開鍋蓋自然冷卻至室溫。后者,加熱 5m in(醫(yī)用微波爐)自然冷卻,再加熱 5m in,取出容器,冷卻容器,抗原修復(fù)后的切片用PBS液洗 3次,每次 5min;(6)10%正常兔血清 37℃孵育 30min;(7)用 PBS液洗 3次,每次 5min,滴加第一抗體 37℃孵育 1 h;(8)PBS液洗 3次,每次5min,滴加第二抗體 37℃孵育 30min;(9)PBS液洗 3次,每次5min,DAB顯色,蘇木素復(fù)染封片;(10)將 60份乳腺癌組織蠟塊,分別用高溫高壓修復(fù)法和微波爐法進(jìn)行抗原修復(fù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

高溫高壓抗原修復(fù)法處理后的乳腺組織切片,細(xì)胞核呈褐色,陽性物質(zhì)定位準(zhǔn)確,陽性與陰性對(duì)比明顯,細(xì)胞結(jié)果與細(xì)胞輪廓完整清晰,其陽性率明顯高于微波爐抗原修復(fù)處理的切片,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表 1。

3 討論

目前進(jìn)行的常規(guī)蠟切片標(biāo)本,一般均用甲醛固定,致使許多抗原決定簇被醛基交聯(lián)封閉,以至于無法和抗體結(jié)合[3],其原因?yàn)椋?1)在甲醛固定過程中形成的醛鍵而封閉了部分抗原決定簇;(2)甲醛在保存過程中會(huì)形成羧甲基,而封閉抗原決定簇;(3)在用固定劑固定時(shí),會(huì)使蛋白與蛋白之間交聯(lián),也可能會(huì)封閉抗原決定簇。抗原修復(fù)是影響染色效果的最關(guān)鍵因素,不同抗原修復(fù)方法直接影響免疫組化染色結(jié)果的表達(dá)[4,5]。酶修復(fù)法是最早的抗原修復(fù)方法,但目前熱修復(fù)法在免疫組化中應(yīng)用較廣。熱修復(fù)抗原其原理是加熱使抗原性物質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)加劇,最終打破封閉的抗原決定簇的化學(xué)鍵和蛋白分子間的交聯(lián),使抗原暴露,達(dá)到修復(fù)的目的[6]。微波爐抗原修復(fù)法通過高頻電磁波將組織中因交聯(lián)性固定劑甲醛處理而形成的醛鍵打開,使抗原暴露,但微波輻射量不均勻,不同區(qū)域的組織所受的處理強(qiáng)度不一,從而出現(xiàn)不同區(qū)域染色深淺不一的現(xiàn)象。高溫高壓修復(fù)法由 Shin[7]首先報(bào)道,用以增進(jìn)組織切片對(duì) tau蛋白的免疫組化的染色。Bank falvi等[8]用高壓鍋對(duì)一些組織抗原進(jìn)行修復(fù)試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)高壓鍋能使甲醛固定,石蠟包埋的組織抗原得到修復(fù),其效果優(yōu)于微波爐。高溫高壓修復(fù)法可使一些常規(guī)免疫組化反應(yīng)呈陰性的組織抗原,經(jīng)過處理后呈陽性表現(xiàn),對(duì)不經(jīng)處理即呈陽性的組織抗原,高溫高壓修復(fù)法可提高第一抗體的稀釋度或縮短孵育時(shí)間,因而提高了病理診斷的準(zhǔn)確率。

表1 高溫高壓抗原修復(fù)法與微波爐抗原修復(fù)法的比較 n=60,例

1 王伯法,李玉松主編.病理學(xué)技術(shù).第 1版.北京：人民衛(wèi)生出版社,2000.354.

2 李英敏,傅中斐,尤紅煜.枸櫞酸鹽緩沖溶液在乳腺癌石蠟切片 ER、PR、PCNA檢測(cè)中應(yīng)用.河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),1998,19：307.

3 倪燦榮主編.病理學(xué)技術(shù).第 1版.北京：人民衛(wèi)生出版社,2000.6,368.

4 駱新蘭,蔡秀珍,劉艷輝,等.不同的抗原修復(fù)條件對(duì)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的影響.中華病理學(xué)雜志,2005,34：52-54.

5 周小鴿,王鵬,陸鳴,等.加熱抗原修復(fù)對(duì)內(nèi)源性生物素蛋白結(jié)合物的影響及其對(duì)策.中華病理學(xué)雜志,2002,31：491-496.

6 唐志校,夏東,王敏,等.幾種組織抗原修復(fù)技術(shù)的討論.診斷病理學(xué)雜志,2002,9：55.

7 Shin RW.Hydrted autoclave pretreatment enhances TAU immunoreactivity in formalin fixed normal and Alzheimers disease brain tissues.Lab invest,1991,64：693.

8 Bankfalvi A,NavabiH,Bier B,etal.Wet autoc lave pretreatment for antigen retrieval diagnostic immunohistochemistry.JPathol,1994,174：223.

R 734.2

A

1002-7386(2010)06-0674-02

054001 河北省邢臺(tái)市第一醫(yī)院病理科

2009-12-25)