劉勇 李輝 李金霞 程池

枯草芽孢桿菌群（Bacillus subtilis group）是枯草芽孢桿菌及其近緣種的總稱，其包括枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）、解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）和萎縮芽孢桿菌（B.atrophaeus）等。枯草芽孢桿菌群細菌能夠產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，在食品、醫(yī)藥、飼料和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域中具有重要應(yīng)用價值，因此對其準確鑒定具有重要理論和實踐意義。

特異PCR技術(shù)（specific PCR）是當(dāng)今快速準確鑒定菌種的方法之一，可避免培養(yǎng)方法和生化鑒定方法的煩瑣，在臨床診斷、食品檢測和土壤微生物鑒定等領(lǐng)域廣為應(yīng)用。特異PCR技術(shù)不僅可以實現(xiàn)微生物種的區(qū)分，也可實現(xiàn)亞種間的區(qū)分，如Torriani（1999）等設(shè)計脯氨酸亞氨基肽酶基因特異引物，通過PCR產(chǎn)物大小成功對Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus和L.delbrueckii subsp.lactis兩個亞種進行了區(qū)分。Oleg等（2004）和權(quán)春善等（2006）利用枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌yyaR、yyaO和tetB-tetL基因順序的差異設(shè)計特異引物，通過特異PCR對二者進行區(qū)分。Idriss等（2002）則根據(jù)枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因差異，通過特異PCR完成了一些枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌的區(qū)分。

β-甘露聚糖酶（β-mannanase，EC 3.2.1.78）是一種半纖維素水解酶，能夠水解半纖維素主要組成成分甘露聚糖類多糖主鏈的1,4-β-甘露糖苷鍵?？莶菅挎邨U菌群中的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌都能夠產(chǎn)生β-甘露聚酶。本文根據(jù)枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌基因組中β-甘露聚糖酶基因(gmuG或ydhT)上下游序列，設(shè)計了3對種特異引物，并以中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection,CICC）保藏的33株枯草芽孢桿菌群細菌作為參考菌株，試圖通過特異PCR方法對枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌進行鑒定區(qū)分。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株33株均為中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）保藏菌種，其中枯草芽孢桿菌（B.subtilis）11 株，CICC 編號為 10020、10076、10077、10078、10088、9011、20522、10260、10261、10262、10263；地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）13 株，CICC 編號為 10084、10085、10086、10087、10101、10181、10182、10266、10332、10334、10335、10336、10340；解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）9株，CICC編號為20164、20604、20605、20606、20661、22383、23260、23281 和 23753。

1.2 主要試劑

Taq DNA聚合酶、dNTP購自天為時代生物有限公司；溶菌酶購自Sigma公司，蛋白酶K購自Merk公司；其它化學(xué)藥品均為進口分析純產(chǎn)品。

1.3 培養(yǎng)基

營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基：蛋白胨5 g/l、牛肉膏3 g/l、氯化鈉5 g/l，pH值7.0。固體培養(yǎng)基則添加瓊脂15 g/l。

1.4 特異PCR引物的設(shè)計

通過分析 B.subtilis subsp.subtilis 168（AL009126）全基因組，B.licheniformis ATCC14580（CP000002）全基因組和 B.amyloliquefaciens FZB42（CP000560）全基因組，發(fā)現(xiàn)三種芽孢桿菌都只具有一種β-甘露聚糖酶基因。根據(jù)三種芽孢桿菌全基因組中β-甘露聚糖酶基因上下游序列設(shè)計了3對種特異性引物（見表1）。引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。

表1 PCR引物

1.5 特異PCR

基因組DNA提取參考文獻。以33株枯草芽孢桿菌群細菌DNA為模版，分別用枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌β-甘露聚糖酶基因特異引物進行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系50 μl：DNA模版0.5 μl（約 10 ng）、10×Taq DNA 聚合酶 Buffer 5 μl、10 pmol/μl dNTP 1 μl、10 pmol/μl正反向引物各 1 μl、2.5 U/μl Taq DNA 聚合酶 0.5 μl、添加 ddH2O 至 50 μl。PCR 反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s；35個循環(huán)；72℃ 10 min；4℃保存。PCR 擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 特異PCR產(chǎn)物的測序

純化PCR產(chǎn)物，用ABI3700測序儀測序。測序由北京寶杰羅生物技術(shù)有限公司完成。測序結(jié)果用DNASTAR軟件參照正反序列圖譜人工校對。

2 結(jié)果

以33株枯草芽孢桿菌群細菌DNA為模版，利用枯草芽孢桿菌特異引物 (Bsu-man-1F和Bsu-man-1R)進行PCR反應(yīng)，結(jié)果如圖1 A：11株枯草芽孢桿菌擴增出長約1300 bp的單一條帶，與預(yù)期產(chǎn)物大小一致；而13株地衣芽孢桿菌和9株解淀粉芽孢桿菌及陰性對照（CK）無條帶。以33株菌DNA為模版，利用地衣芽孢桿菌特異引物 (Bli-man-1F和Bli-man-1R)進行PCR反應(yīng)，結(jié)果如圖1 B：13株地衣芽孢桿菌擴增出長約1300 bp的單一條帶，與預(yù)期大小一致；而11株枯草芽孢桿菌、9株解淀粉芽孢桿菌及陰性對照（CK）無條帶。當(dāng)以33株菌DNA為模版，利用解淀粉芽孢桿菌特異引物(Bam-man-1F和Bam-man-1R)進行PCR反應(yīng)，結(jié)果如圖1 C：9株菌出現(xiàn)長約1300 bp的單一條帶，與預(yù)期產(chǎn)物大小一致；而11株枯草芽孢桿菌、13株地衣芽孢桿菌及陰性對照（CK）無條帶。

PCR產(chǎn)物測序后登錄GenBank，登錄號為GQ859462-GQ859494。序列經(jīng)Blast比對表明，11株枯草芽孢桿菌與模式株B.subtilis subsp.subtilis NCIB3610T（NZ-ABQL01000004）β-甘露聚糖酶基因相似性大于97%；13株地衣芽孢桿菌與模式株B.licheniformis ATCC14580T（CP000002）β-甘露聚糖酶基因相似性大于93%；9株解淀粉芽孢桿菌與模式株B.amyloliquefaciens CCTCC AB94022T(FJ589030)及B.amyloliquefaciens FZB42（CP000560）β-甘露聚糖酶基因相似性大于92%。PCR產(chǎn)物測序結(jié)果表明，特異引物對三種枯草芽孢桿菌群細菌β-甘露聚糖酶基因具有很好的種特異性。

3 討論

特異PCR技術(shù)（specific PCR）具有簡單、快速、準確的優(yōu)點，其在菌種檢測鑒定中具有重要應(yīng)用價值。本文根據(jù)枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌基因組中β-甘露聚糖酶基因上下游序列設(shè)計三種細菌β-甘露聚糖酶基因種特異性引物（見表1），并通過特異PCR方法對三種枯草芽孢桿菌群細菌進行鑒定區(qū)分。實驗結(jié)果表明（見圖1），特異引物對枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌的β-甘露聚糖酶基因具有很好的種特異性，能夠有效區(qū)分這三種芽孢桿菌。該特異PCR方法無需測序，節(jié)約成本；而且較生理生化方法簡便快捷。

β-甘露聚糖酶是一種新型飼料添加劑，其可以促進類胰島素生長因子IGF-I的分泌，促進蛋白質(zhì)的合成，提高瘦肉率；同時，它還可消除豆類中甘露聚糖對葡萄糖吸收的干擾，極大提高餅粕能量消化率。枯草芽孢桿菌群中的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌具有β-甘露聚糖酶基因，可以產(chǎn)生β-甘露聚糖酶?？莶菅挎邨U菌和地衣芽孢桿菌還可作為微生物制劑添加到飼料中，這與它們能夠產(chǎn)生β-甘露聚糖酶等多種水解酶是密不可分的。為了飼料微生物制劑的安全性和有效性，對微生物制劑菌種的準確鑒定十分必要。因而，β-甘露聚糖酶基因特異PCR方法可以用于枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌兩種飼料微生物制劑菌種的鑒定區(qū)分，也可用于檢測兩種飼料微生物制劑菌種的β-甘露聚糖酶基因。

圖1 PCR電泳

[1]Wang L T,Lee F L,Tai C J,et al.Comparison of gyrB gene sequences,16S rRNA gene sequences and DNA-DNA hybridization in the Bacillus subtilis group[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2007,57(8):1846-1850.

[2]田秀媛，孫智杰.產(chǎn)納豆激酶枯草芽孢桿菌種子液培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J].微生物學(xué)雜志，2006，26（1）：54-56.

[3]李朝霞，王愛民，李小敏.中性植酸酶高產(chǎn)菌株的篩選及產(chǎn)酶條件研究[J].微生物學(xué)報，2007，34（4）：633-637.

[4]陳士云，楊寶玉，高梅影，等.一株抑制油菜核盤菌菌核形成的解淀粉芽孢桿菌[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2005，11(3)：373-376.

[5]曹鳳明，沈德龍，李俊，等.應(yīng)用多重PCR鑒定微生物肥料常用芽孢桿菌[J].微生物學(xué)報，2008，48(5)：651-656.

[6]Torriani S,Zapparoll G,Dellaglio F.Use of PCR-Based Methods for Rapid Differentiation of Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus and L.delbrueckii subsp.Lactis [J].Applied And Environmental Microbiology,1999,65(10):4351-4356.

[7]Oleg N R,Christina D,Johan M,et al.Taxonomic characterization and plant colonizing abilities of some bacteria related to Bacillus amyloffquefaciens and Bacillus subtilis[J].FEMS Microbiology E－cology，2004，48：249-259.

[8]權(quán)春善，王軍華，徐洪濤，等.一株抗真菌解淀粉芽孢桿菌的分離鑒定及其發(fā)酵條件的初步研究[J].微生物學(xué)報，2006，46(1)：7-12.

[9]Idriss E E,Makarewic O,Farouk A,et al.Extracellular phytase activity of Bacillus amyloliquefaciens FZB45 contributes to its plant growth-promoting effect[J].Microbiology,2002,148:2097-2109.

[10]Mendoza N S,Arai M,Sugimoto K,et al.Cloning and sequencing of β-mannanase gene from Bacillus subtilis NM-39[J].Biochimicaet Biophysics Acta,1995,1243:552-554.

[11]F.Kunst,N.Ogasawara,I.Moszer,et al.The complete genome sequence of the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis[J].Nature,1997,390(20):249-256.

[12]Michael W Rey,Preethi Ramaiya,Beth A Nelson,et al.Complete genome sequence of the industrial bacterium Bacillus licheniformis and comparisons with closely related Bacillus species[J].Genome Biology,2004,5(10):R77.1-R77.12.

[13]Chen X H,Koumoutsi A,Scholz R,et al.Comparative analysis of the complete genome sequence of the plant growth-promoting bacterium Bacillus amyloliquefaciens FZB42[J].Nature Biotechnology,2007,25:1007-1014.

[14]J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾.黃培堂等譯.分子克隆實驗指南（第三版）[J].北京：科學(xué)出版社，2002.

[15]陳權(quán)軍，鄧岳松，羅永發(fā)，等.新型飼料添加劑——β-甘露聚糖酶[M].中國家禽，2007，29（3）：60-61.