安哲宇，梁志懷，魏 林,，羅秀娟，陳玉榮

（1.中南大學(xué)研究生院隆平分院，湖南 長(zhǎng)沙 410125；2.湖南省植物保護(hù)研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125）

木霉(Trichoderma.spp)作為多種植物病原菌的寄生菌和拮抗菌，是重要的生防因子之一。但野生木霉菌易受外界環(huán)境以及化學(xué)農(nóng)藥的影響，其生防效果不穩(wěn)定。因此，選育對(duì)環(huán)境適性高，特別是對(duì)化學(xué)農(nóng)藥抗性高的優(yōu)良菌株成為植病生防木霉菌在田間廣泛應(yīng)用需要解決的重要問(wèn)題。20世紀(jì)80年代，誘變育種開始用于優(yōu)良木霉菌選育，并獲得了一些對(duì)化學(xué)殺菌劑具有一定抗性且仍保持高拮抗活性的木霉突變型菌株[1-2]。但田間防治是一個(gè)長(zhǎng)期、動(dòng)態(tài)的過(guò)程，保證木霉抗性性狀的穩(wěn)定對(duì)提高生防制劑防治效果，減少化學(xué)農(nóng)藥的使用量有重大意義。

試驗(yàn)利用紫外誘變這一簡(jiǎn)單有效的菌株改良技術(shù)，對(duì)拮抗性優(yōu)良的野生木霉菌株T2-16進(jìn)行遺傳改造，選育出一株對(duì)三唑類殺菌劑具有一定耐藥性的突變體TUV-13。相較于原始菌株，其對(duì)腈菌唑抗性提高10倍。測(cè)定該突變體多代的抗藥性及其對(duì)病原菌的拮抗性，以確定其抗藥性與病原菌拮抗性的遺傳穩(wěn)定性，以期為生防木霉菌的大田應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試木霉菌菌株、植物病原菌和化學(xué)殺菌劑

供試菌株：哈茨木霉（T.harzianum）菌株T2-16，TUV-13均由實(shí)驗(yàn)室自行提供。供試水稻紋枯病菌(Rhizoctonia solani)、魚腥草白絹病菌(Sclerotium rolfsii)、水稻惡苗病菌(Fusarium moniliforme)均分離自田間發(fā)病株。

供試水稻：雜交水稻金優(yōu)402，由湖南隆平種業(yè)有限公司提供。挑選大小、飽滿程度基本一致的種子進(jìn)行試驗(yàn)。

供試藥劑：95%腈菌唑原藥，山東中農(nóng)聯(lián)合生物科技有限公司生產(chǎn)。將供試藥劑用滅菌雙蒸水溶解，配制成1%母液供試。

1.2 耐藥性突變體TUV-13遺傳穩(wěn)定性測(cè)定

1.2.1 突變體的繼代培養(yǎng) 將TUV-13菌株接種到PDA培養(yǎng)基上于25℃條件下培養(yǎng)，每隔7 d挑取菌落邊緣成熟孢子轉(zhuǎn)接一次，連續(xù)轉(zhuǎn)接20次。分別取轉(zhuǎn)接的第5次、第10次和第20次的培養(yǎng)物供試。

1.2.2 TUV-13各代菌株對(duì)腈菌唑抗性的測(cè)定采用菌絲生長(zhǎng)速率法進(jìn)行抗藥性的測(cè)定[3－4]。用濃度梯度法測(cè)定供試藥劑對(duì)培養(yǎng)的木霉突變體TUV-13及其繼代的毒力。將供試藥劑配制成濃度分別為10.0、20.0、40.0、80.0、160.0 mg/L 的含藥平板。將木霉菌菌餅接種于含藥平板正中，28℃下培養(yǎng)。木霉菌絲生長(zhǎng)抑制率參照公式（1）進(jìn)行計(jì)算。

設(shè)置T2-16菌株為對(duì)照組。記錄其生長(zhǎng)勢(shì)的變化，并計(jì)算其EC50值。每組設(shè)置4個(gè)重復(fù)。

1.3 在水稻體內(nèi)定殖后TUV-13抗藥性的測(cè)定

對(duì)采用TUV-13菌株浸種處理組與無(wú)菌水浸種對(duì)照組的水稻幼苗進(jìn)行內(nèi)生菌分離[4]。供試野生木霉菌株對(duì)腈菌唑高度敏感，在腈菌唑濃度大于80.0mg/L的藥劑濃度脅迫下完全不生長(zhǎng)，因此以含腈菌唑濃度為100.0 mg/L的含藥平板作為再分離木霉菌株培養(yǎng)基。從浸種處理組分離獲得的木霉菌株培養(yǎng)性狀與TUV-13完全相同,而對(duì)照組未分離獲得內(nèi)生木霉，可確定處理組分離獲得的木霉菌株即為TUV-13菌株。將分離獲得的TUV-13菌株轉(zhuǎn)于不含藥的PDA平板上純培3 d，然后進(jìn)行抗藥性測(cè)定。

1.4 各代TUV-13菌株基因組RAPD分析

1.4.1 木霉菌DNA的提取 將各代TUV-13菌株與T2-16菌株的孢子分別接于PDS培養(yǎng)基，28℃150 r/min，振蕩培養(yǎng)4 d。用真空泵抽濾發(fā)酵液，將獲得的液培菌絲體以滅菌水反復(fù)清洗干凈，45℃烘干后，采用改進(jìn)的CTAB法提取總DNA[5]。獲得的DNA沉淀用70%乙醇清洗兩次，吹干后溶于50μL的TE(10mmol/L Tris-HCl,1 mmol/L EDTA,pH 8.0)中，并以0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA的完整性。

1.4.2 RAPD分析 RAPD實(shí)驗(yàn)參見吳海云等[6-8]的方法，在實(shí)驗(yàn)前,優(yōu)化了擴(kuò)增和電泳條件,并從50對(duì)隨機(jī)引物(購(gòu)自上海生工)中初步篩選出對(duì)全部DNA樣品均有清晰、穩(wěn)定擴(kuò)增產(chǎn)物且重復(fù)性好的10條引物(參見表1)，再根據(jù)擴(kuò)增條帶數(shù)量對(duì)引物作進(jìn)一步篩選。PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積為25μL，包括 10×PCR 緩沖液 2.5 μL，10 mmol/L dNTP 2.0 μL,5 U/μL Tag酶 0.5 μL，10 μmol/L隨機(jī)引物 1.0 μL，1.0 μL 模板 DNA(約為 50 ng),滅菌雙蒸水補(bǔ)足25μL。反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性5min,94℃變性30 s，37℃退火30 s，72℃延伸60 s;35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物在1×TAE電泳緩沖液中用3%瓊脂糖凝膠電泳，穩(wěn)壓80 V電泳2 h。紫外檢測(cè)儀觀察，記錄條帶數(shù)據(jù)。對(duì)于不同樣本同一引物所擴(kuò)增出的RAPD帶，在同一電泳遷移位置上，有擴(kuò)增條帶的記為1，沒有出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的記為0。統(tǒng)計(jì)結(jié)果以NTSYS 2.10 e處理，構(gòu)建聚類樹。

表1 隨機(jī)引物及其序列

1.5 各代TUV-13菌株對(duì)病原菌的拮抗作用

采用對(duì)峙平板法測(cè)定各代菌株對(duì)水稻紋枯病(R.solani)，魚腥草白絹病(S.rolfsii)，水稻惡苗病(F.moniliforme)的拮抗作用[9]。以水稻分離菌株和T2-16為對(duì)照。每組設(shè)置4個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 各代TUV-13菌株對(duì)腈菌唑抗性的測(cè)定

木霉菌株TUV-13各個(gè)轉(zhuǎn)代對(duì)腈菌唑的耐藥性見表2。結(jié)果顯示，TUV-13菌株各個(gè)轉(zhuǎn)代對(duì)三唑酮的抗藥性均顯著高于原始出發(fā)菌株T2-16，EC50是T2-16的10倍。且其抗藥性在不同世代間的變化極小，總體保持穩(wěn)定。結(jié)果表明，獲得的木霉菌突變體對(duì)腈菌唑抗性并不隨著世代交替而減弱或者消失。

2.2 TUV-13在水稻體內(nèi)定殖后的抗藥性測(cè)定

表2 各代誘變菌株TUV-13與原始菌株T2-16對(duì)腈菌唑的抗性比較

從水稻植株中分離到的木霉菌株TUV-13對(duì)腈菌唑的耐藥性見表3。結(jié)果顯示，從水稻植株分離得到的TUV-13菌株對(duì)腈菌唑的抗藥性同樣顯著高于原始出發(fā)菌株T2-16，并與TUV-13的抗性保持一致。這表明，獲得的木霉菌突變體對(duì)腈菌唑抗性并不因木霉在植物體內(nèi)內(nèi)生定殖而改變或者消失。

表3 水稻分離誘變菌株TUV-13與原始菌株T2-16對(duì)對(duì)腈菌唑的抗性比較

2.3 各代TUV-13菌株基因組RAPD分析

將原始菌株T2-16和TUV-13各世代菌株用對(duì)原始菌株多態(tài)性較好的4個(gè)引物S6，S11，S14，S16進(jìn)行RAPD擴(kuò)增。擴(kuò)增出的DNA片段大小分布在100～750 bp之間，檢測(cè)到條帶位點(diǎn)數(shù)共53條，其中有5條為多態(tài)性帶，占總數(shù)的9.43%。這表明供試木霉菌株間雖然親緣關(guān)系極為接近，但仍存在著一定的遺傳多態(tài)性，利用RAPD標(biāo)記能從DNA水平上檢測(cè)到這些差異（見圖1）。

圖1 木霉菌T2-16與TUV-13突變體各世代RAPD-PCR圖譜比較(引物:S6)

對(duì)RAPD結(jié)果利用CHAN法進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖2所示。所有樣品之間的遺傳距離介于0.00~0.09之間，表明經(jīng)過(guò)誘變處理后，供試木霉菌株間遺傳基因表現(xiàn)出一定改變。其中TUV-13的0代，5代，10代，20代三個(gè)世代（即圖 1中的1，2，3，4泳道）菌株間并無(wú)差異，但與原始菌株 T2-16相比（圖1中的5），表現(xiàn)出了微小的遺傳差異性，遺傳距離有0.09。這說(shuō)明通過(guò)紫外誘變，木霉菌株保留了原始菌株的大部分基因性狀，但變異菌株與原始菌株在基因組上仍存在差異性，且此差異性是能夠穩(wěn)定遺傳的。結(jié)合菌株對(duì)腈菌唑抗性測(cè)定的結(jié)果，這個(gè)基因組上差異極有可能是導(dǎo)致突變株抗性提高且能夠穩(wěn)定遺傳的原因。

圖2 木霉菌株突變體各世代與TUV-13出發(fā)菌T2-16RAPD聚類分析

2.4 各代TUV-13菌株對(duì)病原菌的拮抗作用

各代TUV-13菌株對(duì)供試病原菌的抑菌活性，與出發(fā)菌株相比，均未有顯著變化。并且所有誘變木霉菌株和出發(fā)菌株對(duì)水稻紋枯病菌均表現(xiàn)出重寄生作用，其基質(zhì)占領(lǐng)競(jìng)爭(zhēng)力相對(duì)較差；而對(duì)其它兩種病原菌則均主要表現(xiàn)為競(jìng)爭(zhēng)占領(lǐng)優(yōu)勢(shì)。從水稻中分離出TUV-13菌株的抑菌活性略有下降，這可能是由于培養(yǎng)條件的劇烈改變而引起的暫時(shí)性現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，誘變菌株TUV-13對(duì)植物病原菌的拮抗能力未由于誘變和多代培養(yǎng)而喪失。

表4 各代TUV-13菌株對(duì)病原菌的抑制率 （%）

3 討論

利用綠色生物農(nóng)藥進(jìn)行田間防治是推動(dòng)無(wú)公害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展的一種重要手段。木霉菌作為重要的生防因子，能夠保持耐藥性狀的穩(wěn)定性，對(duì)生物防治病原菌，減少化學(xué)農(nóng)藥在田間的施用，有著積極的意義。

根據(jù)梁志懷等的研究[4－10]，木霉菌不僅對(duì)多種植物病害有較好的防治效果，而且對(duì)水稻種子萌發(fā)和苗期生長(zhǎng)有良好的促進(jìn)作用，定殖在水稻體內(nèi)的木霉菌還能大幅度提高水稻抗病相關(guān)酶（PPO、PAL、POD）的活性。獲得一株穩(wěn)定的抗性標(biāo)記菌株，對(duì)進(jìn)一步研究木霉菌在水稻體內(nèi)的定殖動(dòng)態(tài)及其促生機(jī)理，從而強(qiáng)化木霉菌在大田應(yīng)用，穩(wěn)定其作用效果等有著至關(guān)重要的作用。

實(shí)驗(yàn)的對(duì)象是選育出的抗腈菌唑木霉菌突變體，作為一種對(duì)三唑類殺菌劑有著高耐受性的突變木霉菌株，TUV-13耐藥性穩(wěn)定持續(xù)，并不會(huì)隨著世代的改變以及對(duì)田間作物的定殖而減退或者消失。目前有研究結(jié)果表明，真菌對(duì)三唑類殺菌劑的抗性通常是由微效多基因控制的[11-12]。結(jié)合前續(xù)實(shí)驗(yàn)與RAPD的結(jié)果分析，突變體的抗藥性很可能是來(lái)源于其基因組上微效基因的累加突變。由于木霉菌在PDA平板的培養(yǎng)是無(wú)性繁殖，這種由微效多基因控制的抗性似能穩(wěn)定地遺傳。同時(shí)，突變木霉菌株對(duì)病原菌的抑制作用并未隨著基因突變而消退，使其能夠作為優(yōu)秀的標(biāo)記生防真菌在田間與定殖動(dòng)態(tài)研究中實(shí)用化。

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