安哲宇，梁志懷，魏 林,，羅秀娟，陳玉榮

（1.中南大學(xué)研究生院隆平分院，湖南 長沙 410125；2.湖南省植物保護研究所，湖南 長沙 410125）

木霉(Trichoderma.spp)作為多種植物病原菌的寄生菌和拮抗菌，是重要的生防因子之一。但野生木霉菌易受外界環(huán)境以及化學(xué)農(nóng)藥的影響，其生防效果不穩(wěn)定。因此，選育對環(huán)境適性高，特別是對化學(xué)農(nóng)藥抗性高的優(yōu)良菌株成為植病生防木霉菌在田間廣泛應(yīng)用需要解決的重要問題。20世紀(jì)80年代，誘變育種開始用于優(yōu)良木霉菌選育，并獲得了一些對化學(xué)殺菌劑具有一定抗性且仍保持高拮抗活性的木霉突變型菌株[1-2]。但田間防治是一個長期、動態(tài)的過程，保證木霉抗性性狀的穩(wěn)定對提高生防制劑防治效果，減少化學(xué)農(nóng)藥的使用量有重大意義。

試驗利用紫外誘變這一簡單有效的菌株改良技術(shù)，對拮抗性優(yōu)良的野生木霉菌株T2-16進行遺傳改造，選育出一株對三唑類殺菌劑具有一定耐藥性的突變體TUV-13。相較于原始菌株，其對腈菌唑抗性提高10倍。測定該突變體多代的抗藥性及其對病原菌的拮抗性，以確定其抗藥性與病原菌拮抗性的遺傳穩(wěn)定性，以期為生防木霉菌的大田應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試木霉菌菌株、植物病原菌和化學(xué)殺菌劑

供試菌株：哈茨木霉（T.harzianum）菌株T2-16，TUV-13均由實驗室自行提供。供試水稻紋枯病菌(Rhizoctonia solani)、魚腥草白絹病菌(Sclerotium rolfsii)、水稻惡苗病菌(Fusarium moniliforme)均分離自田間發(fā)病株。

供試水稻：雜交水稻金優(yōu)402，由湖南隆平種業(yè)有限公司提供。挑選大小、飽滿程度基本一致的種子進行試驗。

供試藥劑：95%腈菌唑原藥，山東中農(nóng)聯(lián)合生物科技有限公司生產(chǎn)。將供試藥劑用滅菌雙蒸水溶解，配制成1%母液供試。

1.2 耐藥性突變體TUV-13遺傳穩(wěn)定性測定

1.2.1 突變體的繼代培養(yǎng) 將TUV-13菌株接種到PDA培養(yǎng)基上于25℃條件下培養(yǎng)，每隔7 d挑取菌落邊緣成熟孢子轉(zhuǎn)接一次，連續(xù)轉(zhuǎn)接20次。分別取轉(zhuǎn)接的第5次、第10次和第20次的培養(yǎng)物供試。

1.2.2 TUV-13各代菌株對腈菌唑抗性的測定采用菌絲生長速率法進行抗藥性的測定[3－4]。用濃度梯度法測定供試藥劑對培養(yǎng)的木霉突變體TUV-13及其繼代的毒力。將供試藥劑配制成濃度分別為10.0、20.0、40.0、80.0、160.0 mg/L 的含藥平板。將木霉菌菌餅接種于含藥平板正中，28℃下培養(yǎng)。木霉菌絲生長抑制率參照公式（1）進行計算。

設(shè)置T2-16菌株為對照組。記錄其生長勢的變化，并計算其EC50值。每組設(shè)置4個重復(fù)。

1.3 在水稻體內(nèi)定殖后TUV-13抗藥性的測定

對采用TUV-13菌株浸種處理組與無菌水浸種對照組的水稻幼苗進行內(nèi)生菌分離[4]。供試野生木霉菌株對腈菌唑高度敏感，在腈菌唑濃度大于80.0mg/L的藥劑濃度脅迫下完全不生長，因此以含腈菌唑濃度為100.0 mg/L的含藥平板作為再分離木霉菌株培養(yǎng)基。從浸種處理組分離獲得的木霉菌株培養(yǎng)性狀與TUV-13完全相同,而對照組未分離獲得內(nèi)生木霉，可確定處理組分離獲得的木霉菌株即為TUV-13菌株。將分離獲得的TUV-13菌株轉(zhuǎn)于不含藥的PDA平板上純培3 d，然后進行抗藥性測定。

1.4 各代TUV-13菌株基因組RAPD分析

1.4.1 木霉菌DNA的提取 將各代TUV-13菌株與T2-16菌株的孢子分別接于PDS培養(yǎng)基，28℃150 r/min，振蕩培養(yǎng)4 d。用真空泵抽濾發(fā)酵液，將獲得的液培菌絲體以滅菌水反復(fù)清洗干凈，45℃烘干后，采用改進的CTAB法提取總DNA[5]。獲得的DNA沉淀用70%乙醇清洗兩次，吹干后溶于50μL的TE(10mmol/L Tris-HCl,1 mmol/L EDTA,pH 8.0)中，并以0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的完整性。

1.4.2 RAPD分析 RAPD實驗參見吳海云等[6-8]的方法，在實驗前,優(yōu)化了擴增和電泳條件,并從50對隨機引物(購自上海生工)中初步篩選出對全部DNA樣品均有清晰、穩(wěn)定擴增產(chǎn)物且重復(fù)性好的10條引物(參見表1)，再根據(jù)擴增條帶數(shù)量對引物作進一步篩選。PCR擴增反應(yīng)總體積為25μL，包括 10×PCR 緩沖液 2.5 μL，10 mmol/L dNTP 2.0 μL,5 U/μL Tag酶 0.5 μL，10 μmol/L隨機引物 1.0 μL，1.0 μL 模板 DNA(約為 50 ng),滅菌雙蒸水補足25μL。反應(yīng)程序為95℃預(yù)變性5min,94℃變性30 s，37℃退火30 s，72℃延伸60 s;35個循環(huán)，72℃延伸10min。擴增產(chǎn)物在1×TAE電泳緩沖液中用3%瓊脂糖凝膠電泳，穩(wěn)壓80 V電泳2 h。紫外檢測儀觀察，記錄條帶數(shù)據(jù)。對于不同樣本同一引物所擴增出的RAPD帶，在同一電泳遷移位置上，有擴增條帶的記為1，沒有出現(xiàn)擴增條帶的記為0。統(tǒng)計結(jié)果以NTSYS 2.10 e處理，構(gòu)建聚類樹。

表1 隨機引物及其序列

1.5 各代TUV-13菌株對病原菌的拮抗作用

采用對峙平板法測定各代菌株對水稻紋枯病(R.solani)，魚腥草白絹病(S.rolfsii)，水稻惡苗病(F.moniliforme)的拮抗作用[9]。以水稻分離菌株和T2-16為對照。每組設(shè)置4個重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 各代TUV-13菌株對腈菌唑抗性的測定

木霉菌株TUV-13各個轉(zhuǎn)代對腈菌唑的耐藥性見表2。結(jié)果顯示，TUV-13菌株各個轉(zhuǎn)代對三唑酮的抗藥性均顯著高于原始出發(fā)菌株T2-16，EC50是T2-16的10倍。且其抗藥性在不同世代間的變化極小，總體保持穩(wěn)定。結(jié)果表明，獲得的木霉菌突變體對腈菌唑抗性并不隨著世代交替而減弱或者消失。

2.2 TUV-13在水稻體內(nèi)定殖后的抗藥性測定

表2 各代誘變菌株TUV-13與原始菌株T2-16對腈菌唑的抗性比較

從水稻植株中分離到的木霉菌株TUV-13對腈菌唑的耐藥性見表3。結(jié)果顯示，從水稻植株分離得到的TUV-13菌株對腈菌唑的抗藥性同樣顯著高于原始出發(fā)菌株T2-16，并與TUV-13的抗性保持一致。這表明，獲得的木霉菌突變體對腈菌唑抗性并不因木霉在植物體內(nèi)內(nèi)生定殖而改變或者消失。

表3 水稻分離誘變菌株TUV-13與原始菌株T2-16對對腈菌唑的抗性比較

2.3 各代TUV-13菌株基因組RAPD分析

將原始菌株T2-16和TUV-13各世代菌株用對原始菌株多態(tài)性較好的4個引物S6，S11，S14，S16進行RAPD擴增。擴增出的DNA片段大小分布在100～750 bp之間，檢測到條帶位點數(shù)共53條，其中有5條為多態(tài)性帶，占總數(shù)的9.43%。這表明供試木霉菌株間雖然親緣關(guān)系極為接近，但仍存在著一定的遺傳多態(tài)性，利用RAPD標(biāo)記能從DNA水平上檢測到這些差異（見圖1）。

圖1 木霉菌T2-16與TUV-13突變體各世代RAPD-PCR圖譜比較(引物:S6)

對RAPD結(jié)果利用CHAN法進行聚類分析，結(jié)果如圖2所示。所有樣品之間的遺傳距離介于0.00~0.09之間，表明經(jīng)過誘變處理后，供試木霉菌株間遺傳基因表現(xiàn)出一定改變。其中TUV-13的0代，5代，10代，20代三個世代（即圖 1中的1，2，3，4泳道）菌株間并無差異，但與原始菌株 T2-16相比（圖1中的5），表現(xiàn)出了微小的遺傳差異性，遺傳距離有0.09。這說明通過紫外誘變，木霉菌株保留了原始菌株的大部分基因性狀，但變異菌株與原始菌株在基因組上仍存在差異性，且此差異性是能夠穩(wěn)定遺傳的。結(jié)合菌株對腈菌唑抗性測定的結(jié)果，這個基因組上差異極有可能是導(dǎo)致突變株抗性提高且能夠穩(wěn)定遺傳的原因。

圖2 木霉菌株突變體各世代與TUV-13出發(fā)菌T2-16RAPD聚類分析

2.4 各代TUV-13菌株對病原菌的拮抗作用

各代TUV-13菌株對供試病原菌的抑菌活性，與出發(fā)菌株相比，均未有顯著變化。并且所有誘變木霉菌株和出發(fā)菌株對水稻紋枯病菌均表現(xiàn)出重寄生作用，其基質(zhì)占領(lǐng)競爭力相對較差；而對其它兩種病原菌則均主要表現(xiàn)為競爭占領(lǐng)優(yōu)勢。從水稻中分離出TUV-13菌株的抑菌活性略有下降，這可能是由于培養(yǎng)條件的劇烈改變而引起的暫時性現(xiàn)象。實驗結(jié)果表明，誘變菌株TUV-13對植物病原菌的拮抗能力未由于誘變和多代培養(yǎng)而喪失。

表4 各代TUV-13菌株對病原菌的抑制率 （%）

3 討論

利用綠色生物農(nóng)藥進行田間防治是推動無公害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展的一種重要手段。木霉菌作為重要的生防因子，能夠保持耐藥性狀的穩(wěn)定性，對生物防治病原菌，減少化學(xué)農(nóng)藥在田間的施用，有著積極的意義。

根據(jù)梁志懷等的研究[4－10]，木霉菌不僅對多種植物病害有較好的防治效果，而且對水稻種子萌發(fā)和苗期生長有良好的促進作用，定殖在水稻體內(nèi)的木霉菌還能大幅度提高水稻抗病相關(guān)酶（PPO、PAL、POD）的活性。獲得一株穩(wěn)定的抗性標(biāo)記菌株，對進一步研究木霉菌在水稻體內(nèi)的定殖動態(tài)及其促生機理，從而強化木霉菌在大田應(yīng)用，穩(wěn)定其作用效果等有著至關(guān)重要的作用。

實驗的對象是選育出的抗腈菌唑木霉菌突變體，作為一種對三唑類殺菌劑有著高耐受性的突變木霉菌株，TUV-13耐藥性穩(wěn)定持續(xù)，并不會隨著世代的改變以及對田間作物的定殖而減退或者消失。目前有研究結(jié)果表明，真菌對三唑類殺菌劑的抗性通常是由微效多基因控制的[11-12]。結(jié)合前續(xù)實驗與RAPD的結(jié)果分析，突變體的抗藥性很可能是來源于其基因組上微效基因的累加突變。由于木霉菌在PDA平板的培養(yǎng)是無性繁殖，這種由微效多基因控制的抗性似能穩(wěn)定地遺傳。同時，突變木霉菌株對病原菌的抑制作用并未隨著基因突變而消退，使其能夠作為優(yōu)秀的標(biāo)記生防真菌在田間與定殖動態(tài)研究中實用化。

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