姜小華 張柳 王曉希

臨床發(fā)現(xiàn),骨折合并腦外傷的患者,相對(duì)單純骨折患者,其骨痂的數(shù)量多、骨折愈合的速度快[1]。1987年 Perkins等[2]報(bào)道了這一現(xiàn)象,國(guó)內(nèi)學(xué)者也通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這一現(xiàn)象[3],但其作用機(jī)制仍未明確。近年來(lái),細(xì)胞因子在腦外傷促進(jìn)骨折愈合方面的研究日益受到重視。我們通過(guò)免疫組織化學(xué)染色和原位雜交技術(shù),研究大鼠骨折合并腦外傷時(shí)血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet-derived grow th factor,PDGF)含量的變化與骨折位點(diǎn)的表達(dá),探討 PDGF在腦外傷時(shí)骨折愈合過(guò)程中可能的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 12周雄性 SD大鼠 32只,體重(356±25)g,購(gòu)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中于室溫 20℃自然光照的動(dòng)物房中分籠飼養(yǎng),供給大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料,自用飲用水。定期紫外線(xiàn)消毒與排風(fēng)。喂養(yǎng) 1周適應(yīng)環(huán)境后隨機(jī)分為 4組,每組 8只：A組為骨折合并腦外傷 1周組,A 1組為單純骨折 1周組,B組為骨折合并腦外傷 2周組,B1組為單純骨折 2周組。

1.2 主要試劑 PDGF多克隆抗體、HRP SPKit、PDGF-B多點(diǎn)標(biāo)記的 DIG探針原位雜交試劑盒由天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司提供。

1.3 模型制作 大鼠經(jīng) 100ml/L水合氯醛(3ml/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉后,制作腦損傷模型[4]：常規(guī)去毛、備皮、碘伏消毒,顯露右顱頂骨,中線(xiàn)旁 2mm處開(kāi)直徑 5mm骨窗,將 20 g砝碼于 30 cm高處通過(guò)導(dǎo)向桿墜落,撞擊置于硬膜上的圓錐致中度腦損傷。股骨干骨折模型的制作[5]：右下肢股外側(cè)切口,沿股外側(cè)肌間隙鈍性分離至股骨干,在股骨干中 1/3用線(xiàn)鋸斷成橫行骨折,然后以直徑 1.5mm克氏針逆行從大粗隆穿出,復(fù)位后將克氏針順行穿入股骨遠(yuǎn)端髓腔,確認(rèn)牢固后,0.9%氯化鈉溶液沖洗傷口,分層關(guān)閉切口,碘伏再消毒。肌內(nèi)注射青霉素至術(shù)后 5 d(5萬(wàn) U/d)預(yù)防感染。術(shù)畢分籠飼養(yǎng)。

1.4 標(biāo)本采集與處理 分別將受試大鼠經(jīng)水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉后,于術(shù)后第 1、2周心臟取血處死,每組 8只,取大鼠右側(cè)完整的股骨標(biāo)本,0.9%氯化鈉溶液沖洗,攝CR片。在無(wú)菌條件下以骨痂為中心截取股骨中 1/3段(包括骨痂、皮質(zhì)骨、骨髓成分),迅速去除周?chē)浗M織,將標(biāo)本置入 4%的多聚甲醛液(DEPC水 +PBS配制)中固定過(guò)夜,PBS液沖洗后,置 20%EDTA(DEPC水配制)液中 4℃脫鈣約 5周。取骨痂及周?chē)M織依次經(jīng)過(guò)脫水、透明、浸蠟、包埋,備用(所用液體試劑均需用DEPC處理或DEPC水配制,接觸標(biāo)本及容器的洗滌均用 DEPC水。實(shí)驗(yàn)容器及器械在實(shí)驗(yàn)前 1天置高溫烘烤,溫度≥180℃,時(shí)間≥8 h)。

1.5 觀(guān)察指標(biāo)

1.5.1 計(jì)算機(jī) X線(xiàn)攝像儀(CR)攝片：將大鼠完整的右側(cè)股骨干骨折標(biāo)本經(jīng) CR攝片(距離：90 cm,電壓：40 kV,電流：3.2mA),觀(guān)察大鼠股骨骨折骨痂的連續(xù)性及骨折愈合情況。

1.5.2 HE染色：制備 5μm石蠟切片,經(jīng)脫蠟、水化、蘇木素染核、鹽酸酒精分化、伊紅染漿、脫水透明,最后中性樹(shù)膠封片,光鏡下觀(guān)察骨痂生長(zhǎng)情況及其組織形態(tài)。

1.5.3 免疫組織化學(xué)染色：制備 5μm石蠟切片,常規(guī)脫蠟至水,3%H2O2溶液封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,5%山羊血清封閉非特異性抗原,加一抗(1∶100)于 4℃孵育過(guò)夜,滴加生物素化二抗,高敏過(guò)氧化物酶復(fù)合物,DAB顯色,蘇木素復(fù)染。每次染色均用PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照。采用 HPIAS-1000高清晰度彩色圖像分析系統(tǒng)(同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)千屏影像工程公司),在400倍視野下,隨機(jī)選取 6個(gè)視野,統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野總的細(xì)胞數(shù)和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù),以 6個(gè)視野的平均值作為此標(biāo)本的 PDGF陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。

1.5.4 原位雜交：制備 5μm石蠟切片 DEPC水撈片(雜交專(zhuān)用玻片),置 56℃烤箱過(guò)夜后脫蠟至水,室溫置打孔液后10min,3%雙氧水 20m in封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,滴加復(fù)合消化工作液 30min,預(yù)雜交工作液 37℃濕盒孵育 1h,滴加雜交工作液 37℃濕盒孵育 4 h,滴加小鼠抗地高辛生物素標(biāo)記的抗體工作液 37℃濕盒孵育 45min,高敏過(guò)氧化物酶復(fù)合物 37℃濕盒孵育 45m in,DAB顯色,蘇木素復(fù)染。每次染色均用寡核苷酸陰性探針雜交液代替雜交工作液作為陰性對(duì)照。采用HPIAS-1000高清晰度彩色圖像分析系統(tǒng)(同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)千屏影像工程公司),在 400倍視野下,隨機(jī)選取 6個(gè)視野,統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野總的細(xì)胞數(shù)和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù),以 6個(gè)視野的平均值作為此標(biāo)本的 PDGFmRNA陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。(操作時(shí)戴無(wú)菌手套,所用液體試劑均需用 DEPC處理或 DEPC水配制,接觸標(biāo)本及容器的洗滌均用 DEPC水。實(shí)驗(yàn)容器及器械在實(shí)驗(yàn)前 1天置高溫烘烤,溫度≥180℃,時(shí)間≥8 h。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用 SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以±s表示,采用單因素方差分析和t檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 X線(xiàn)片觀(guān)察 在同一時(shí)間點(diǎn)骨折合并腦外傷組較單純骨折組對(duì)位對(duì)線(xiàn)好,骨折端骨痂形成早,骨痂大,骨折愈合加快。見(jiàn)圖 1。

圖 1 X線(xiàn)片觀(guān)察

2.2 HE染色 A組可見(jiàn)較多早期軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞;A 1組骨折間隙可見(jiàn)成纖維細(xì)胞,僅夾雜有少量的早期軟骨細(xì)胞;B組骨折端有新生骨小梁長(zhǎng)入;B1組未見(jiàn)有骨小梁形成。

2.3 免疫組織化學(xué)染色 以細(xì)胞中含有明顯的棕黃色顆粒者為陽(yáng)性表達(dá)。術(shù)后 1周骨膜內(nèi)增殖細(xì)胞、骨折端周?chē)庋拷M織中的纖維母細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、早期軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞胞漿均出現(xiàn)廣泛的強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng),合并腦外傷組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量多于單純骨折組,并且顯色強(qiáng)。圖像分析顯示,A、B組平均陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)均高于同一時(shí)間點(diǎn) A 1、B1組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表 1。

2.4 原位雜交 以細(xì)胞中含有明顯的棕黃色顆粒者為陽(yáng)性表達(dá)。成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、早期軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞胞漿在不同時(shí)間點(diǎn)分別出現(xiàn)廣泛的PDGFmRNA表達(dá),骨痂 PDGFmRNA含量在 2周表達(dá)增強(qiáng),PDGFmRNA陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)比較且 A、B組骨痂 PDGFmRNA陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)均顯著高于同一時(shí)間點(diǎn) A 1、B1組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表 1。

表 1 4組 PDGF平均陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和 PDGFmRNA表達(dá)水平比較n=8,%,±s

表 1 4組 PDGF平均陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和 PDGFmRNA表達(dá)水平比較n=8,%,±s

注：與A 1組比較,＊P＜0.05;與B1組比較,#P＜0.05

組別 PDGF平均陽(yáng)性細(xì)胞 PDGFmRNA平均陽(yáng)性細(xì)胞A組 0.872±0.021＊ 0.385±0.046＊A1組 0.803±0.042 0.204±0.042 B組 0.781±0.036# 0.602±0.050#B1組 0.712±0.027 0.438±0.026

3 討論

大量臨床病例發(fā)現(xiàn)：骨折患者若同時(shí)伴有腦外傷,其骨折愈合過(guò)程明顯加快,甚至在未見(jiàn)骨折的某些關(guān)節(jié)周?chē)霈F(xiàn)異位骨化現(xiàn)象[1-3]。本次實(shí)驗(yàn)CR片和HE染色發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)合并腦損傷的骨折愈合明顯好于單純骨折組,表明腦損傷可以促進(jìn)骨折愈合。關(guān)于腦外傷后加速骨折愈合的調(diào)節(jié)因素,國(guó)內(nèi)外學(xué)者已開(kāi)始在分子生物學(xué)水平進(jìn)行研究,并逐漸認(rèn)識(shí)到細(xì)胞因子的特殊作用[6-10]。我們的實(shí)驗(yàn)從蛋白水平和基因水平研究骨折愈合中骨痂 PDGF的變化,發(fā)現(xiàn)骨折合并腦外傷組 PDGF和PDGFmRNA表達(dá)均顯著高于同一時(shí)間點(diǎn)單純骨折組,PDGFmRNA在 1周時(shí)有陽(yáng)性表達(dá)后逐漸增強(qiáng),2周出現(xiàn)高峰表達(dá),PDGF在骨折愈合過(guò)程中分別在不同細(xì)胞內(nèi)呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。故我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示腦損傷促進(jìn)了骨折局部 PDGF及 PDGFmRNA的表達(dá),峰值上調(diào)。

骨折愈合是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,受到各種因素的嚴(yán)格控制,其中起主要作用的是局部的骨生長(zhǎng)因子或細(xì)胞因子。各種生長(zhǎng)因子協(xié)同作用促進(jìn)骨折的愈合,其中PDGF在成骨及骨重建過(guò)程中起著重要作用[11]。作為重要的有絲分裂原,PDGF可在創(chuàng)傷骨組織中高效表達(dá),對(duì)成骨細(xì)胞的增殖、分化起重要作用：PDGF能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞早期的 DNA合成,使成骨細(xì)胞從靜止?fàn)顟B(tài)的 G0/G 1期進(jìn)入到有復(fù)制潛能的 S期,使分泌期細(xì)胞增多;同時(shí)還能增強(qiáng)單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的游走性,使局部成纖維細(xì)胞增殖、分化,從而促進(jìn)骨形成[12]。在我們的研究中,免疫組織化學(xué)染色和原位雜交結(jié)果顯示骨痂組織中有 PDGF及PDGFmRNA的表達(dá),前者在 1周時(shí)就有高峰表達(dá),2周仍持續(xù)強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),后者早期表達(dá)主要在新生毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞,2周時(shí)有高峰表達(dá),提示PDGF早期可能以旁分泌形式啟動(dòng)后又刺激多種細(xì)胞自分泌并參與了骨折早期修復(fù)的過(guò)程。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,腦外傷時(shí)骨折部位PDGF的表達(dá)增加,骨折愈合加速,PDGF可能在腦外傷加速骨折愈合中起了重要作用。此研究為臨床促進(jìn)骨折愈合,及骨折不愈合和延遲愈合、骨質(zhì)疏松骨折的分子治療提供重要參考依據(jù)。

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