阿布力克木 王衛(wèi)星 徐勝 張昌威 余佳 陳辰

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)進展快,病程兇險,是臨床上常見的嚴重急腹癥,病死率為 15% ～35%[1]。急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是胰腺炎胰外器官損傷中最常見的表現(xiàn),發(fā)生率高達 60%～70%[2],發(fā)病 1周死亡約30%存在ALI和急性呼吸窘迫綜合征。ⅡA型分泌型磷脂酶A2(groupⅡA secreted phospholipase A2,sPLA2-Ⅱ A)通過直接損傷破壞質(zhì)膜、間接產(chǎn)生炎性介質(zhì)、趨化激活炎性細胞,引起肺部炎性反應(yīng),對肺泡上皮細胞毛細血管內(nèi)皮和肺表面活性物質(zhì)都有直接的損傷作用[3]。本實驗使用的 sPLA2-ⅡA由北京大學(xué)化學(xué)院研制,將其應(yīng)用于大鼠 SAP模型,探討該新型特異性磷脂酶 A2(PLA2)抑制劑在 SAP相關(guān)性肺損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗分組、模型制備以及獲取標本 Wistar大鼠 24只,體重 200～250 g(湖北省疾病預(yù)防控制中心提供),隨機分為 3組,每組 8只：假手術(shù)組(SO組),SAP模型組(SAP組),抑制劑預(yù)處理組(抑制劑組,5mg/kg)。實驗前禁食 12 h,禁水 4 h。以 10%水合氯醛腹腔注射(3ml/kg)麻醉,無菌操作下行上腹正中切口進腹,采用 4.5號頭皮針頭穿過十二指腸對系膜緣經(jīng)乳頭逆行插入主胰管,5%牛磺膽酸鈉(STC)溶液(1m l/kg)沿胰膽管逆行恒速(0.1ml/m in)注射造模。確認沿胰管周圍組織出現(xiàn)水腫、充血,出血等改變,表明造模成功,后關(guān)腹。術(shù)后皮下補液(2ml/100 g)。

SAP組：術(shù)前 30m in股靜脈注射等體積不含 sPLA2-ⅡA抑制劑的溶劑(10%DMSO),然后制備胰腺炎模型。SO組：術(shù)前30min股靜脈注射等體積不含 sPLA2-ⅡA抑制劑的溶劑,膽胰管逆行注射等體積的 0.9%氯化鈉溶液。抑制劑組：術(shù)前30min股靜脈分別注射 10%DMSO溶解的 sPLA2-ⅡA抑制劑(5mg/kg),制備 SAP模型,同 SAP組。

1.2 材料與試劑 STC購自Sigma公司,使用前無菌 0.9%氯化鈉溶液配置。新型 sPLA2-ⅡA(pku-mdl-101)由北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院提供,用 10%DMSO新鮮配置,sPLA2活性測定均采用 sPLA2活性分析試劑盒檢測(cayman公司,美國)。

1.3 檢測指標

1.3.1 生化指標：采用本院檢驗科臨床使用的全自動生化分析儀測定血清淀粉酶。

1.3.2 胰腺組織病理學(xué)檢測：大鼠胰腺組織用 10%甲醛固定24 h,石蠟包埋切片,行 HE染色,根據(jù) Sadurska等[4]提出的方法,對胰腺水腫、胰腺腺泡壞死、出血和脂肪壞死、炎性和血管周圍炎性浸潤光鏡下進行組織學(xué)評分。

1.3.3 肺組織病理學(xué)檢測：大鼠肺組織用 10%甲醛固定 24 h,石蠟包埋切片,行 HE染色,光鏡下按 Osman等[5]的標準進行組織學(xué)評分。

1.3.4 肺濕干比：取大鼠右中肺稱量肺濕重,置 60℃烤箱連續(xù)烘烤 72h,稱量肺干重,計算肺濕干比值。

1.3.5 血清和肺組織 sPLA2-ⅡA活性檢測：組織勻漿液由100mmol/L Tris HCl緩沖液,pH值 7.0,包含 1mmol/L EDTA、10mmol/L CaCl2及 0.3mmol/L Triton。按照 2ml勻漿液∶1 g組織的比例,使用 IKA自動勻漿機(德國)冰上勻漿,10 000 r/min低溫(4℃)離心 30min,取勻漿液上清。sPLA2活性測定均采用 sPLA2活性分析試劑盒(sPLA2asssay kit)檢測(cayman公司,美國),包括 sPLA2分析緩沖液、DTNB、Diheptanoyl Thio-PC底物。

1.3.6 肺組織 sPLA2ⅡA表達：大鼠肺臟組織 PLA2mRNA表達分析：肺臟組織異硫氰酸胍一步法提取細胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系包括細胞總RNA 1μl,5X逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液 7μl,隨機引物 2μl,M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Gibeo)200U,37℃反應(yīng) 60min,99℃ 5min終止反應(yīng)。上機 94℃變性 45 s,54℃退火 45 s,72℃延伸 45 s,共 35個循環(huán)。經(jīng) 2%瓊脂糖凝膠電泳,紫外光下觀察照相。用生物電泳凝膠成像系統(tǒng)測出PLA2mRNA和 β-actin表達強度,并計算樣本擴增產(chǎn)物與β-actin的積分光密度比值。PLA2mRNA引物上游序列 5'-GCTTCTACGGTTGCCATTGT-3';下游序列為：5'-AACTGGGCGTCTTCCCTTT-3'。內(nèi)參照 βactin(207bp)：上游 5'-CCAACTGGGACGATATGGAG-3';下游'-CAGAGGCATACAGGGACAAC-3';(Invitrogen公司設(shè)計并合成)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用 SPSS 13.0統(tǒng)計軟件,計量資料以±s表示,多組間進行單因素方差分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清淀粉酶和胰腺炎病理評分 造模后 12 h,SAP組血清淀粉酶明顯高于 SO組(P＜0.01),抑制劑組血清淀粉酶較SAP組明顯降低(P＜0.01),但仍高于 SO組(P＜0.01)。造模后 12 h,SO組胰腺結(jié)構(gòu)正常,幾乎無水腫、出血及炎性細胞浸潤,SAP組胰腺正常結(jié)構(gòu)被破壞,腺泡水腫、出血、壞死明顯,大量炎性細胞浸潤,病理評分較SO組顯著增高(P＜0.01),抑制劑組胰腺腺泡壞死、出血、炎性細胞浸潤,病理評分與SAP組比較均有所改善(P＜0.01)。見表 1。

2.2 肺組織病理學(xué)檢測 大體觀察：SO組大鼠肺組織肉眼觀正常;SAP組造模后 12h胸腔有積液,肺水腫加劇,肺表面呈暗紅色,可見散在小出血點;抑制劑組肺水腫較SAP組減輕。光鏡下觀察：SO組大鼠肺組織鏡下結(jié)構(gòu)基本正常;SAP 12 h組出現(xiàn)肺泡和間質(zhì)水腫、出血,灶性或片狀肺不張,肺泡間隔增寬,大量炎性細胞浸潤,肺組織結(jié)構(gòu)紊亂等改變;抑制劑組肺臟上述病變程度明顯減輕,表現(xiàn)在肺間質(zhì)充血、炎細胞浸潤減輕。抑制劑組肺組織病理評分較SAP組減輕(P＜0.01)。見表1。2.3 肺濕干重比 SAP組造模后 12 h肺濕干比為 2.214±0.275,抑制劑組肺濕干比 1.568±0.024較 SAP組明顯降低(P＜0.01)。SAP組肺濕干比與 SO組 1.500±0.07比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。見表 1。

表 1 3組大鼠血清淀粉酶、胰腺病理評分、肺病理評分及肺濕干比例比較n=8,±s

表 1 3組大鼠血清淀粉酶、胰腺病理評分、肺病理評分及肺濕干比例比較n=8,±s

注：與 SO組比較,＊P＜0.01;與 SAP組比較,#P＜0.01

組別 淀粉酶(U/L) 胰腺病理評分 肺病理評分 肺濕干比SO組 1 270±400 0.3±0.5 0.23±0.42 1.500±0.701 SAP組 7 272±1 842＊ 11.6 ±1.0＊ 2.24 ±0.79＊ 2.214±0.275＊抑制劑組 4 524 ±605＊# 8.4 ±0.8＊# 1.62 ±0.52＊# 1.568±0.024＊#

2.4 血清和肺組織 PLA2活性 造模后 12 h,SAP組、抑制劑組血清和肺組織 PLA2活性較 SO組均明顯升高(P＜0.01),抑制劑組血清和肺組織 PLA2活性與 SAP組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。見表 2。

2.5 肺組織sPLA2-ⅡA mRNA表達分析 SO組大鼠肺組織PLA2mRNA表達微弱,SAP組造模后12h表達水平升高,與 SO組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);抑制劑組PLA2m RNA表達水平較 SAP組明顯降低(P＜0.01),但表達較SO組仍升高(P＜0.01)。 SO組 sPLA2-Ⅱ A mRNA/β-actin灰度比值與SA組和抑制劑組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);SAP組sPLA2-ⅡA mRNA/β-actin灰度比值與抑制劑組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。見表 2、圖 1。

表 2 3組大鼠血清和肺組織 PLA 2活性、肺組織PLA2-ⅡA-mRNA/-acti灰度比值比較n=8,±s

表 2 3組大鼠血清和肺組織 PLA 2活性、肺組織PLA2-ⅡA-mRNA/-acti灰度比值比較n=8,±s

注：與SO組比較,＊P＜0.01;與SAP組比較,#P＜0.01

組別血清 PLA2活性(μmol? min-1? L-1)肺組織 PLA2活性(mol? min-1? L-1)sPLA2-ⅡA mRNA/β-actin灰度比值SO組 475±50 56±9 1.33±0.27 SAP組 707±48＊ 109±13＊ 1.86±0.11＊抑制劑組 581±58＊# 87±9＊# 1.60±0.13＊#

圖 1 肺臟 sPLA2 mRNA表達的結(jié)果

3 討論

PLA2是一類存在于細胞膜的磷脂水解酶,廣泛分布于細胞的質(zhì)膜、細胞器。它分為分泌型 PLA2(sPLA2)、胞漿型 PLA2(cPLA2)及非鈣依賴型 PLA2(iPLA2)。sPLA2包括 PLA2-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅸ和Ⅹ,均為小分子水溶性蛋白質(zhì),都具有一個含天門冬氨酸和組氨酸的催化位點,其最大活性依賴結(jié)合于酶活性中心的 Ca2+濃度以及合適的 pH值水平。其中,sPLA2-ⅡA富二硫鍵、低分子量(14.4 kDa)、最適 pH值為 7～9,鈣離子依賴型。正常哺乳動物組織細胞中sPLA2-ⅡA低表達。急性胰腺炎時 sPLA2在胰腺、肺等強表達,參與了胰腺局部壞死和系統(tǒng)性炎性的進展[6,7]。

本實驗建立大鼠 SAP模型,觀察肺濕干比例、肺組織病理改變,發(fā)現(xiàn) SAP組大鼠發(fā)生了嚴重的肺損害,同時肺組織sPLA2-ⅡA mRNA表達、sPLA2活性增高,這提示了 sPLA2參與了 SAP相關(guān)性肺損害過程。有研究表明,sPLA2-ⅡA作用于肺泡表面活性物質(zhì),使其分解為對細胞有毒性的溶血卵磷脂,肺泡活性物質(zhì)的減少導(dǎo)致肺泡表面張力增加,肺順應(yīng)性降低,最終導(dǎo)致肺損傷[8,9]。此外,sPLA2-ⅡA可以直接分解膜磷脂,破壞膜結(jié)構(gòu),增加細胞膜的通透性,從而直接損傷肺泡Ⅱ型上皮細胞結(jié)構(gòu)和功能,導(dǎo)致肺組織損傷[9]。通過研究發(fā)現(xiàn),sPLA2-ⅡA可通過NF-kB途徑刺激巨噬細胞內(nèi)iNOS的表達,產(chǎn)生過氧化亞硝酸鹽而損傷肺組織[10]。

本研究使用的新型PLA2抑制劑由北京大學(xué)化學(xué)院研制,是一種特異性分泌型 PLA2的抑制劑,對 sPLA2-ⅡA具有較強抑制作用。我們前期研究當中,發(fā)現(xiàn)了 5mg/kg劑量是減輕SAP大鼠胰腺病例損傷的較安全,有效劑量。本研究中,SAP組大鼠血清淀粉酶,胰腺病理評分,血清sPLA2活性等指標高于 SO組,表明 sPLA2與胰腺炎嚴重程度密切相關(guān)。

在應(yīng)用該抑制劑的SAP大鼠,不僅上述指標均低于 SAP組,而且肺組織 sPLA2-ⅡA mRNA表達降低、sPLA2活性亦明顯被抑制,并減輕了肺組織的病理損傷評分。因此,應(yīng)用該新型PLA2抑制劑對SAP相關(guān)性肺損傷較好的保護作用。

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