程丹丹，葛菁萍，宋 剛，凌宏志，趙 丹，平文祥

（黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150080）

乳鏈菌肽（Nisin）又稱之為乳酸鏈球菌素或乳酸鏈球菌肽，是從乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）發(fā)酵產(chǎn)物中制備的一種多肽抗菌素類物質(zhì)[1]。它能抑制大部分革蘭氏陽性菌及其芽孢的生長和繁殖，是國際上允許商業(yè)化生產(chǎn)的食品防腐劑[2]。隨著研究的深入，其應(yīng)用范圍已擴(kuò)展到造紙、活性食品包裝、農(nóng)業(yè)飼料、生殖避孕、醫(yī)學(xué)移植等新的領(lǐng)域[3]。

發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化是提高乳鏈菌肽效價的重要途徑之一。響應(yīng)面法是利用合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對回歸方程的分析來尋求最優(yōu)的工藝參數(shù)[4]，該方法在微生物培養(yǎng)條件優(yōu)化中得到廣泛應(yīng)用[5-10]。本試驗(yàn)利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)法[11]和響應(yīng)面法對產(chǎn)乳鏈菌肽的乳酸乳球菌DU101的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）DU101，藤黃微球菌（Micrococcus luteus）HDBTHW-01。以上菌株均由黑龍江大學(xué)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基和初始發(fā)酵培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基:蛋白胨 10 g·L-1，牛肉膏 10 g·L-1，酵母膏 5 g·L-1，葡萄糖 5 g·L-1，無水乙酸鈉 5 g·L-1，檸檬酸銨 2 g·L-1，K2HPO42 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.2 g·L-1，MnSO4·H2O 0.05 g·L-1，吐溫 80 為 2mL·L-1，pH6.8，1×105Pa滅菌20 min。效價檢測培養(yǎng)基:胰蛋白胨8 g·L-1，酵母膏 5 g·L-1，葡萄糖 5 g·L-1，氯化鈉 5 g·L-1，NaH2PO42 g·L-1，瓊脂 7.5 g·L-1，pH 6.8，1×105Pa滅菌20 min。

1.1.3 主要試劑

Nisin標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)條件

從斜面上挑取適量DU101接至種子培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)12h。將獲得的種子培養(yǎng)液按5%的接種量接至發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)24 h后，以HDBTHW-01為指示菌，測定發(fā)酵液中Nisin效價。

1.2.2 Nisin效價的測定

Nisin的效價采用瓊脂擴(kuò)散法測定[10]。

1.2.3 Plackett-Burman設(shè)計(jì)

根據(jù)Nisin生物合成過程特點(diǎn)，結(jié)合前期單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取影響Nisin效價的8個因素，選用試驗(yàn)次數(shù)n=24的設(shè)計(jì)，并加上6個中心點(diǎn)即單因素試驗(yàn)的最高點(diǎn)，篩選和探討8個試驗(yàn)因素對Nisin發(fā)酵的影響，從而獲得顯著性因素。試驗(yàn)因素及水平見表1。

表1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)因素及水平Table1 Experimental factors and levels in Plackett-Burman

1.2.4 最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)Plackett-Burman設(shè)計(jì)的結(jié)果，來確定是否進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)。若需要進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，通過Plackett-Burman設(shè)計(jì)找到顯著因素，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果所顯示的正負(fù)效應(yīng)確定因素水平增加或減少，以顯著因素的零水平為試驗(yàn)起點(diǎn)，選擇合適步長進(jìn)行梯度試驗(yàn)，找到Nisin效價最高的實(shí)驗(yàn)處理，即為響應(yīng)面分析法的中心點(diǎn)。

1.2.5 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)

篩選出影響Nisin效價的關(guān)鍵因子后，根據(jù)SAS軟件中的響應(yīng)面設(shè)計(jì)模塊程序，采用中心組合設(shè)計(jì)法對關(guān)鍵因子進(jìn)行優(yōu)化，其中關(guān)鍵因子各取5個水平值，非關(guān)鍵因子取0水平值。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式的回歸擬和，預(yù)測Nisin效價最大值及其所對應(yīng)的關(guān)鍵因子的濃度。

1.2.6 響應(yīng)面模型的驗(yàn)證

以多元二次方程所預(yù)測的最佳培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行20組發(fā)酵試驗(yàn)，以驗(yàn)證模型的有效性。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman篩選重要因子

碳源、氮源以及各種無機(jī)鹽對Nisin的發(fā)酵結(jié)果有重要的影響。為了獲得價格低廉而發(fā)酵效果較好的培養(yǎng)基，首先要考慮培養(yǎng)基成分的選擇。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，葡萄糖作為碳源其發(fā)酵效果較好；蛋白胨、牛肉膏以及復(fù)合氮源對Nisin發(fā)酵的效果較好，但是成本很高，而玉米漿來源廣泛，營養(yǎng)豐富，價格低廉，并且發(fā)酵效果也較好，因此選擇玉米漿作為氮源；檸檬酸銨、K2HPO4、無水乙酸鈉、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、吐溫 80 也對Nisin發(fā)酵有一定的影響，因此也作為影響因素進(jìn)行考察。

應(yīng)用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選重要因子，選擇影響Nisin發(fā)酵的8種成分:玉米漿、葡萄糖、檸檬酸銨、K2HPO4、無水乙酸鈉、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、吐溫80，分別作為 Plackett-Burman試驗(yàn)的8個因素X1、X2、X3、…X8，選取n=24的Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個因素選取兩個水平，并加上6個中心點(diǎn)，以Nisin效價為響應(yīng)值Y。試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，所得結(jié)果見表3。

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)原則，8個因素共進(jìn)行24次試驗(yàn)（見表2）?；貧w分析的決定系數(shù)R2=0.9735，說明回歸分析能夠確切的描述試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table2 Experimental design and results of Plackett-Burman

表3 Plackett-Burman設(shè)計(jì)回歸分析Table3 Regression analysis of Plackett-Burman design

利用SAS軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得出各因素的T值和可信度水平。一般選擇可信度大于90%以上的因素作為重要因素。從表3可以看出葡萄糖和無水乙酸鈉的可信度分別為99.73%、91.05%，均大于90%，表明兩者對Nisin發(fā)酵影響顯著。而其他6個因子如玉米漿、檸檬酸銨、K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、吐溫 80 的可信度都小于90%，因此對Nisin發(fā)酵影響不顯著。根據(jù)T值可以看出，葡萄糖和無水乙酸鈉對Nisin的發(fā)酵起著非常顯著的正效應(yīng)（t值分別為9.29988、2.477065）。由此可以確定葡萄糖和無水乙酸鈉是主要的影響因子，可進(jìn)行下一步優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2 最陡爬坡試驗(yàn)

應(yīng)用SAS統(tǒng)計(jì)分析軟件，將Plackett-Burman設(shè)計(jì)中的結(jié)果代入t檢驗(yàn)程序，比較中心點(diǎn)水平的平均響應(yīng)值與試驗(yàn)點(diǎn)處的平均響應(yīng)值間的差異顯著性，所得結(jié)果見表4、5。

表4 t檢驗(yàn)結(jié)果Table4 Result of t-tests

表5 方差齊性檢驗(yàn)結(jié)果Table5 Result of equality of variances

由方差齊性檢驗(yàn)的結(jié)果可知，P＜0.05，說明中心點(diǎn)與試驗(yàn)點(diǎn)方差非齊性。由此得出T檢驗(yàn)的結(jié)果，P＜0.05，說明曲面夠曲，中心點(diǎn)與實(shí)驗(yàn)點(diǎn)間存在顯著差異，即Plackett-Burman設(shè)計(jì)中選取的中心點(diǎn)已經(jīng)接近最大的響應(yīng)區(qū)域內(nèi)，不需要通過最陡爬坡試驗(yàn)進(jìn)一步靠近最優(yōu)點(diǎn)。

2.3 中心組合試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)的結(jié)果，利用SAS軟件設(shè)計(jì)中心組合試驗(yàn)，其中葡萄糖對應(yīng)于自變量X1，無水乙酸鈉對應(yīng)于自變量X2，以Nisin效價作為響應(yīng)值Y，各自變量水平見表6，其余6個因子取單因素試驗(yàn)的最高點(diǎn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表7。

表6 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平Table6 Experimental factors and levels of central composite design(g·L-1)

表7 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及其實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table7 Experiment design and results of central composite design

2.4 響應(yīng)面回歸分析

通過SAS的響應(yīng)面回歸進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立二次響應(yīng)面回歸模型，并進(jìn)而尋求最優(yōu)相應(yīng)因子水平，回歸方程偏回歸系數(shù)估計(jì)值及方差分析結(jié)果分別見表 8、9。

運(yùn)用SAS軟件回歸擬合表8的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，得到二次回歸方程:Y=1450.187＋273.64497X1＋131.88101X2－251.0838X12－15.75X1X2－87.83345X22。由方差分析可知，其 F=11.26198，概率（P＞F）值=0.002696，表明模型在α=0.01水平上顯著。該模型方程的決定系數(shù)為R2=0.9061，說明回歸方程的擬合程度良好，可應(yīng)用于分析和預(yù)測發(fā)酵過程N(yùn)isin的產(chǎn)量。

通過回歸方程繪制分析圖，考察所擬合的相應(yīng)曲面的形狀，響應(yīng)面曲面如圖1所示。由圖1可知此模型存在最大值，對回歸方程求導(dǎo)可以得到模型的極值，葡萄糖為6.57 g·L-1，無水乙酸鈉為7.11 g·L-1，Nisin效價預(yù)測最大響應(yīng)值為1561 IU·mL-1。

表8 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)回歸分析結(jié)果Table8 Regression analysis of central composite design

表9 中心組合實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析Table9 ANOVA for the central composite design

圖1 葡萄糖和無水乙酸鈉對Nisin效價的影響Fig.1 Response surface plot of the effects of glucose and NaAc on the Nisin concentration

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了驗(yàn)證模型預(yù)測的準(zhǔn)確性，利用優(yōu)化的葡萄糖和無水乙酸鈉含量，其余6個因子取單因素試驗(yàn)的最佳含量作為發(fā)酵培養(yǎng)基，重復(fù)試驗(yàn)20次，測得的Nisin的效價為1564±19 IU·mL-1，試驗(yàn)值與理論預(yù)測值非常接近，說明用響應(yīng)面法來尋找最佳發(fā)酵培養(yǎng)基是可行的。此時Nisin效價比優(yōu)化前的1389 IU·mL-1提高了12.6%。

3 討論與結(jié)論

Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法因試驗(yàn)次數(shù)少，周期短，求得回歸方程精度高，已廣泛應(yīng)用于發(fā)酵培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件的優(yōu)化等，但應(yīng)用在Nisin發(fā)酵培養(yǎng)基上的報(bào)道比較少。李孱等[12]以細(xì)菌素產(chǎn)量較高的CM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，采用了部分因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，估計(jì)因子的主效及部分交互作用，首次利用響應(yīng)面方法對影響細(xì)菌素產(chǎn)量的培養(yǎng)基各組分進(jìn)行評價，并對主要因子進(jìn)行優(yōu)化得到較好的結(jié)果。

本試驗(yàn)在李孱等[12]研究的基礎(chǔ)上，改進(jìn)了設(shè)計(jì)方法，采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)法選取了影響Nisin效價的8個因素，共24組試驗(yàn)，將響應(yīng)面分析法運(yùn)用于Nisin發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化，結(jié)果證明其效果較好。借助SAS統(tǒng)計(jì)軟件快速獲得了對Nisin效價影響顯著的兩個因素，分別是葡萄糖和無水乙酸鈉。根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)原理，通過響應(yīng)面試驗(yàn)對這兩個主要因素進(jìn)一步優(yōu)化，以求尋找出最佳值。通過優(yōu)化確定的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:玉米漿5 g·L-1，葡萄糖 6.57 g·L-1，檸檬酸銨 3 g·L-1，K2HPO42 g·L-1，無水乙酸鈉 7.11 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.2 g·L-1，MnSO4·H2O 0.05 g·L-1，吐溫 80 為 2mL·L-1。在此條件下，Nisin效價達(dá)到了1564 IU·mL-1，比優(yōu)化前提高了12.6%。該試驗(yàn)為乳鏈菌肽的進(jìn)一步開發(fā)和利用奠定了基礎(chǔ)。

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