王繼佳，李鳳蘭，韓 峰，孫麗麗，金 峰

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

仙客來(lái)（Cyclamen premium Mill.）屬報(bào)春花科仙客來(lái)屬的多年生球根草本植物，是世界著名的節(jié)日小盆花之一。仙客來(lái)灰霉病是溫室中常見(jiàn)的真菌病害[1]，其病原為富克爾核盤(pán)菌，屬子囊菌門(mén)真菌，由氣流傳播，主要通過(guò)傷口侵入植物體。該病主要發(fā)生在葉片、葉柄、花梗和花瓣上[2]。據(jù)2005年調(diào)查，仙客來(lái)灰霉病在1～3月低溫時(shí)發(fā)病率高達(dá)90%，對(duì)花卉種子的產(chǎn)量和品質(zhì)均有很大影響[3]。近幾年來(lái)，由于連年栽培、菌源積累等原因，仙客來(lái)的灰霉病病害越來(lái)越重，已成為影響仙客來(lái)欣賞價(jià)值和商品價(jià)值的關(guān)鍵因素。有關(guān)仙客來(lái)灰霉病的研究主要集中在病原鑒定及診斷和防治等方面[3-5]，而對(duì)患病植株?duì)I養(yǎng)器官內(nèi)部變化的研究則少有報(bào)道。

本文運(yùn)用石蠟切片技術(shù)對(duì)患灰霉病仙客來(lái)植株的葉片、葉柄、花、花梗進(jìn)行了解剖學(xué)觀(guān)察，為進(jìn)一步研究仙客來(lái)灰霉病的起源、發(fā)生、傳播及其防治提供解剖學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

仙客來(lái)的正常植株和染灰霉病的典型病株為同一品種，其來(lái)源于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

選取仙客來(lái)染病植株具有代表性的葉片（長(zhǎng)0.5 cm，寬0.3 cm）、葉柄（0.5 cm）、花（長(zhǎng)0.5 cm，寬0.3 cm）、花梗（0.5 cm），用FAA固定24 h以上，常規(guī)石蠟切片法制片，切片厚度為l0 μm，番紅-固綠雙重染色，封片后，于OLYMPUS光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察并拍照。

本研究選擇6種組織內(nèi)的細(xì)胞,在顯微鏡下每種組織隨機(jī)選取5個(gè)視野，觀(guān)察每個(gè)視野中含有菌絲或孢子的細(xì)胞比例，并計(jì)算出在此組織中的平均數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 患病植株的外部形態(tài)特征

對(duì)正常仙客來(lái)植株和患灰霉病植株外觀(guān)形態(tài)的對(duì)比觀(guān)察，發(fā)現(xiàn)灰霉病主要危害葉片、葉柄及花冠（見(jiàn)圖1、2）。由觀(guān)察結(jié)果可以看出，灰霉病主要危害葉片、葉柄及花冠。染病葉片表面有暗綠色水漬狀病斑，干燥條件下葉斑呈“V”字形褐斑，看不見(jiàn)灰霉；葉柄和花梗呈水漬狀腐爛；花瓣發(fā)病時(shí)變色，白色品種花瓣變成淡褐色，紅色品種的花瓣退色，并出現(xiàn)水漬狀圓斑，病重時(shí)花瓣腐爛，密生灰色霉層，即病原菌分生孢子?；蚍稚咦樱绊懹^(guān)賞性，這些特點(diǎn)與已報(bào)道結(jié)果一致[4]。

圖1 正常仙客來(lái)植株的葉片和花瓣Fig.1 Leaves and flowers of normal cyclamen plant

圖2 感病仙客來(lái)植株的葉片和花瓣Fig.2 Leaves and flowers of cyclamen plant with Botrytis cinerea infection

2.2 灰霉病病原菌對(duì)仙客來(lái)器官的侵染方式

在番紅-固綠的染色條件下，灰霉病病原菌的菌絲被染成綠色，分生孢子被染成紅色[6]。對(duì)患病的不同器官進(jìn)行解剖學(xué)觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，病原菌主要通過(guò)器官的表皮進(jìn)行侵染，但不同器官的侵染過(guò)程有所差別。從患病葉片來(lái)看，病原菌大部分是以菌絲直接通過(guò)葉片下表皮細(xì)胞進(jìn)入葉片組織，并在表皮細(xì)胞中產(chǎn)生大量分生孢子，從而破壞表皮細(xì)胞（見(jiàn)圖3）。

圖3 感病仙客來(lái)葉片橫切面（×100）Fig.3 Transverse section of cyclamen leaves with Botrytis cinerea infection（×100）

病原菌對(duì)花瓣的侵染過(guò)程與之相似，也是首先在表皮細(xì)胞中產(chǎn)生了大量菌絲，繼而侵染內(nèi)部組織細(xì)胞（見(jiàn)圖4）。病原菌對(duì)仙客來(lái)葉柄和花梗的侵染，都是通過(guò)表皮進(jìn)行的，其破壞表皮細(xì)胞的方式同葉片相似，即在表皮細(xì)胞中產(chǎn)生大量分生孢子（見(jiàn)圖5）。

圖4 感病仙客來(lái)花瓣橫切面（×400）Fig.4 Transverse section of cyclamen flowers with Botrytis cinerea infection（×400）

2.3 患灰霉病仙客來(lái)植株中的病原菌分布及其存在狀態(tài)

2.3.1 灰霉病病原菌在葉片中的分布及其存在狀態(tài)

圖5 感病仙客來(lái)花梗縱切面（×100）Fig.5 Vertical section of cyclamen pedicels with Botrytis cinerea infection（×100）

由表1可知，灰霉病病原菌的菌絲及分生孢子在葉片不同組織中的分布有很大差異。上下表皮中菌絲分布量較多，而其他組織中菌絲分布較少，尤其在韌皮部中，幾乎沒(méi)有菌絲存在；分生孢子在葉片的下表皮中分布量較大，并且密集度達(dá)到最高，為44.0%，而上表皮中的分生孢子量卻很少，只有6.0%，這與解剖結(jié)構(gòu)觀(guān)察到病原菌通過(guò)葉片下表皮進(jìn)行侵染的結(jié)論相一致。在葉脈的木質(zhì)部和韌皮部中也有較多的分生孢子存在（見(jiàn)圖3）。

表1 灰霉病病原菌在葉片中的分布及其存在狀態(tài)Table1 Distribution and state of pathogens in cyclamen leaves (%)

2.3.2 灰霉病病原菌在葉柄中的分布及其存在狀態(tài)

由表2可知，菌絲在葉柄中主要分布于表皮、皮層和韌皮部，其中在韌皮部中的含量最多，達(dá)到了極顯著的水平，而木質(zhì)部和髓中幾乎沒(méi)有菌絲的存在。在葉柄的不同組織細(xì)胞中都有病原菌的分生孢子，分生孢子呈圓形。葉柄表皮細(xì)胞中的分生孢子數(shù)量最多，達(dá)到40.6%，明顯高于其他組織，其中木質(zhì)部中的含量最少。葉柄髓部受病原菌感染的程度最低（見(jiàn)圖6）。

表2 灰霉病病原菌在葉柄中的分布及其存在狀態(tài)Table2 Distribution and state of pathogens in the cyclamen petioles (%)

圖6 感病仙客來(lái)葉柄橫切面（×40）Fig.6 Transverse section of cyclamen petioles with Botrytis cinerea infection（×40）

2.3.3 灰霉病病原菌在花瓣中的分布及其存在狀態(tài)

由表3可知，花瓣表皮細(xì)胞中存在著較多的絲狀菌絲和分生孢子，而薄壁細(xì)胞中分生孢子和菌絲的含量都較少。在花瓣維管束中分生孢子最多，為41.3%，但菌絲的含量最少，只有11.0%（見(jiàn)圖7）。這同灰霉病病原菌在葉片和葉柄各組織中的分布趨勢(shì)相一致。

表3 灰霉病病原菌在花瓣中的分布及其存在狀態(tài)Table3 Distribution and state of pathogens in cyclamen flowers (%)

圖7 感病仙客來(lái)花瓣橫切面（×400）Fig.7 Transverse section of cyclamen flowers with Botrytis cinerea infection（×400）

2.3.4 灰霉病病原菌在花梗中的分布及其存在狀態(tài)

由表4可知，在花梗中，幾乎沒(méi)有菌絲，病原菌主要以分生孢子的形式存在，其中表皮細(xì)胞中的分生孢子數(shù)量最多，達(dá)49.8%，而韌皮部中的量最低，僅為2.0%（見(jiàn)圖8）。

表4 灰霉病病原菌在花梗中的分布及其存在狀態(tài)Table4 Distribution and state of pathogens in cyclamen pedicels (%)

圖8 感病仙客來(lái)花?？v切面（×400）Fig.8 Vertical section of cyclamen pedicels with Botrytis cinerea infection（×400）

3 討論與結(jié)論

3.1 石蠟切片技術(shù)在患灰霉病仙客來(lái)器官觀(guān)察中的應(yīng)用

對(duì)受到真菌病害侵染的植株內(nèi)部變化的觀(guān)察方法主要有細(xì)胞、亞細(xì)胞水平、生理生化以及基因分子水平的方法[7]。本試驗(yàn)采用石蠟切片技術(shù)結(jié)合番紅-固綠染色方法對(duì)仙客來(lái)患病植株的器官進(jìn)行解剖學(xué)觀(guān)察，主要是從細(xì)胞水平上揭示仙客來(lái)感染灰霉病后其感病器官的解剖結(jié)構(gòu)特征。由于被真菌感染的細(xì)胞壁角質(zhì)化加厚[8]，經(jīng)番紅-固綠染色后呈紅色，因此有利于對(duì)感病細(xì)胞的確定和觀(guān)察；此外，細(xì)胞中的分生孢子和菌絲在染色中呈現(xiàn)出不同的顏色反應(yīng)，其中分生孢子易被番紅染成紅色，而菌絲則被固綠染成綠色，也便于試驗(yàn)結(jié)果的觀(guān)察，因此，石蠟切片方法可以用于受真菌侵染植株的內(nèi)部變化的觀(guān)察。

3.2 仙客來(lái)植株被灰霉病病原菌侵染方式和位置

植物病原真菌侵入寄主并在寄主組織中生長(zhǎng)是其致病的先決條件[8]。病原菌在入侵寄主時(shí)，通常會(huì)產(chǎn)生一些由特化的菌絲形成的侵染結(jié)構(gòu)，如：侵染墊[9-10]、附著胞[11]、侵染釘和吸器[12-13]等來(lái)幫助入侵并與寄主建立寄生關(guān)系。但是，侵染墊和附著胞并不是侵入所必需的[14]。所以病原菌的侵染可歸納為以侵染墊或裂片狀附著胞侵染、不產(chǎn)生專(zhuān)門(mén)侵染結(jié)構(gòu)由菌絲頂端直接穿透植物表面或從自然孔口（主要是氣孔）及傷口侵入幾種情況[15-16]。在本試驗(yàn)中，感病仙客來(lái)的不同器官中都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)菌絲的特化結(jié)構(gòu)，可能是由于所選取試驗(yàn)材料已經(jīng)過(guò)了感染的最初期，但是在觀(guān)察過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，灰霉病病原菌在葉片、葉柄、花瓣和花梗中的分布特點(diǎn)比較一致，即表皮部位病原菌的密集度最高，表明灰霉病病原菌可能是通過(guò)表皮進(jìn)行侵染，被侵染的葉片中可以觀(guān)察到有很多病原體的菌絲是直接通過(guò)葉片下表皮的氣孔進(jìn)入植株組織的。在真菌侵染的表皮部位，都含有大量分生孢子，這種分布既有利于真菌侵染組織細(xì)胞，也有利于孢子向外傳播。至于在侵染初期是否產(chǎn)生了其他特化結(jié)構(gòu)，還需進(jìn)一步觀(guān)察和研究。

3.3 灰霉病病原菌在仙客來(lái)器官中的傳播

蔣軍喜等對(duì)真菌侵染植物的研究發(fā)現(xiàn)，游動(dòng)孢子在侵入植物時(shí)先回縮鞭毛，接著將自身固定在植物表面，然后侵入寄主細(xì)胞質(zhì)中[17]。本試驗(yàn)中有些患病器官的解剖結(jié)構(gòu)顯示，當(dāng)孢子從表皮進(jìn)入皮層后,先在皮層細(xì)胞內(nèi)定殖并形成大量菌絲，然后進(jìn)一步向皮層和其他組織細(xì)胞擴(kuò)展，而且真菌菌絲在皮層內(nèi)的擴(kuò)展方向一般是先橫向后縱向。導(dǎo)管中的分生孢子可沿導(dǎo)管縱向擴(kuò)展，同時(shí)分生孢子還可穿越導(dǎo)管進(jìn)行橫向擴(kuò)展，因此，在重病植株體內(nèi)，分生孢子量比較大的導(dǎo)管周?chē)募?xì)胞中，往往也存在著大量分生孢子，說(shuō)明病原菌在病株體內(nèi)的縱、橫向擴(kuò)展，可能是由分生孢子本身不斷生長(zhǎng)發(fā)育來(lái)完成的，但具體的機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。分生孢子縱橫向擴(kuò)展時(shí)，在植株體內(nèi)的某一部位還能因其大量產(chǎn)生而使導(dǎo)管填塞，進(jìn)而導(dǎo)致花梗和花瓣枯萎死亡。

[1]原國(guó)輝,高一鳳,程玉琴,等.仙客來(lái)幾種主要病害的識(shí)別與防治[J].農(nóng)業(yè)科技通訊,2001(2):26-27.

[2]孫文英,周麗.仙客來(lái)主要病害診斷與防控措施[J].遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué),2007(5):45-46.

[3]張蕾,王福銀,李陽(yáng)春,等.仙客來(lái)灰霉病的病原鑒定及其生物學(xué)特性研究[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào),2008,14(1):168-171.

[4]王利平.仙客來(lái)灰霉病的診斷及防治[J].技術(shù)與市場(chǎng),2006(11):32.

[5]雷玉明.仙客來(lái)灰霉病的診斷及防治[J].中國(guó)花卉盆景,2002(5):41.

[6]王建明,鄭經(jīng)武,賀運(yùn)春,等.西瓜枯萎病菌在植株體內(nèi)的存在狀態(tài)、數(shù)量分布及擴(kuò)展規(guī)律的研究[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),1993,26(3):69-74.

[7]鄭玲,吳小芹.植物病原真菌侵染結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2007(1):90-94.

[8]譚小明,郭順星.紅豆杉根的顯微結(jié)構(gòu)及其內(nèi)生真菌分布[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào),2006(6):372-374.

[9]Dodman R L,Barker K R,Walker J C.A detailed study of the different modes of penetration by Rhizoctonia sulani[J].Phytopathology,1968,58:1271-1276.

[10]Dodman R L,Flentje N T.The mechanism and physiology of plant penetration by Rhizoctonia solani[J].Biology and Pathology,1970(5):149-160.

[11]Emmett R W,Parbery D G.Appressoria[J].Ann Rev Phytopathol,1975,13:147-167.

[12]Riopel J L,Timko M P.Haustorial initiation and differentiation[M]//Press M C,Graves J D.Parasitic plants.New York:Chapman and Hall Press,1995:39-79.

[13]黃國(guó)紅,康振生,朱之,等.小麥葉銹菌在感病寄主上發(fā)育的組織病理學(xué)和超微結(jié)構(gòu)研究[J].植物病理學(xué)報(bào),2003,33(1):52-56.

[14]張紅生,朱立宏,沙學(xué)延,等.水稻紋枯病抗性機(jī)理的初步研究[M]//朱立宏.主要農(nóng)作物抗病性研究進(jìn)展.南京:江蘇科技出版社,1990:153-164.

[16]Deising H B,Wnener S.The role of fungal appressoriain plant infection[J].Microbes and in Infection,2000,2(13):1631-1641.

[16]Marshall D S,Rush M C.Relation between infection by Rhizoctonia sulani and R.oryzae and disease severity in rice[J].Phytopathology,1980,70:941-946.

[17]蔣軍喜,蔡祝南.植物病毒的真菌傳播及傳毒介體油壺菌研究進(jìn)展[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2003,25(3):362-365.