任立杰，佟慧麗，李慶章，高學(xué)軍

（乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030）

謝規(guī)律可以為調(diào)節(jié)奶牛乳腺發(fā)育能量負(fù)平衡，提高奶牛生產(chǎn)性能提供重要的理論基礎(chǔ)。一般對(duì)奶牛能量代謝的研究往往停留于脂肪酸、氨基酸等物質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)調(diào)控與奶牛乳腺發(fā)育泌乳能量代謝水

能量是高產(chǎn)奶牛發(fā)揮泌乳潛力的重要因素，能量攝入量不足是影響高產(chǎn)奶牛泌乳量和乳品質(zhì)的因素之一，特別是高產(chǎn)奶牛泌乳初期，能量代謝往往處于負(fù)平衡。研究奶牛乳腺發(fā)育的能量代平的關(guān)系[1-3]。目前，一些研究者對(duì)小鼠不同發(fā)育時(shí)期乳腺組織中的能量代謝相關(guān)酶的表達(dá)變化進(jìn)行了系統(tǒng)的測(cè)定[4-5]。Rudolph等同時(shí)對(duì)乳腺中一些酶作用的底物如α-和β-型的葡萄糖、乳糖、半乳糖濃度進(jìn)行了測(cè)定[5]。糖和脂肪是重要的能源物質(zhì)，其中三羧酸循環(huán)、糖異生、糖酵解、磷酸戊糖途徑及脂肪酸氧化等代謝途徑與能量代謝有密切關(guān)系。而代謝途徑中的酶作為生物反應(yīng)的催化劑，其相對(duì)數(shù)量決定代謝反應(yīng)的進(jìn)程和方向，對(duì)代謝過(guò)程具有重要的調(diào)節(jié)作用。本研究旨在通過(guò)對(duì)奶牛乳腺各個(gè)發(fā)育時(shí)期重要代謝途徑的關(guān)鍵酶及重要代謝產(chǎn)物的系統(tǒng)研究揭示奶牛乳腺發(fā)育與泌乳能量代謝的規(guī)律，為奶牛泌乳調(diào)控技術(shù)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用乳腺組織來(lái)自澳洲進(jìn)口健康荷斯坦奶牛，飼養(yǎng)于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧高新技術(shù)園區(qū)。根據(jù)奶牛乳腺發(fā)育的特點(diǎn)，分別在青春期2個(gè)月（V2M）、12個(gè)月（V12M）、14個(gè)月（V14M）；妊娠期2個(gè)月（P2M）、4個(gè)月（P4M）、6個(gè)月（P6M）；圍產(chǎn)前期（WC）；泌乳期 7 d（L7 d）、50 d（L50 d）、140 d（L140 d）、280 d（L280 d）、退化期 3 d（I3 d）、30 d（I30 d）4個(gè)時(shí)期共設(shè)立13個(gè)取樣點(diǎn)各剖殺1頭奶牛取乳腺組織，乳腺組織采集后，DEPC水沖洗，迅速轉(zhuǎn)入DEPC處理過(guò)的凍存管中，液氮凍存后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱備用。

1.2 試劑

己糖激酶（Hexokinase，HK）測(cè)試盒（南京建成）；葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（Glucose-6-Phosphatase Dehydrogenase，G-6-PD）活性終點(diǎn)比色法定量檢測(cè)試劑盒（上海杰美）；異檸檬酸脫氫酶（Isocitrate Dehydrogenase，ICDH）活性檢測(cè)試劑盒（上海杰美）；葡萄糖（Glucose，Glu）測(cè)定試劑盒（南京建成）；乳糖（Lactose，LAC）標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自天津軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院；ATP酶測(cè)定試劑盒（南京建成）；甘油三酯（Triglyceride，TG）測(cè)定試劑盒（南京建成）；牛β-酪蛋白（β-casein）標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma）；其他常規(guī)實(shí)驗(yàn)藥品及試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 設(shè)備

ZHJH-1112垂直流超凈工作臺(tái)；上海智城分析儀器制造有限公司；LC-10AT高效液相色譜儀，日本島津；2695-2996型HPLC色譜儀，美國(guó)Waters；Delta-600-2487制備型HPLC色譜儀，美國(guó)Waters；SBA系列生化分析儀，賽諾邁德醫(yī)學(xué)技術(shù)有限責(zé)任公司；SZ-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器，上海亞榮生化儀器廠。

1.4 方法

HK、G-6-PDH、ICDH、ATP酶活性、葡萄糖及TG的測(cè)定方法遵照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，試驗(yàn)中每個(gè)指標(biāo)做3次重復(fù)，下同。

HPLC法測(cè)定乳糖的分泌情況方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[6]；

HPLC法測(cè)定β-酪蛋白的分泌情況方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[7]；

能荷、NADPH的測(cè)定方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[8]。

1.5 結(jié)果統(tǒng)計(jì)

采用SigmaPlot 9.0軟件對(duì)相關(guān)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并采用Excel軟件對(duì)統(tǒng)計(jì)分析后的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶活性的檢測(cè)結(jié)果

己糖激酶活性在各個(gè)時(shí)期變化量不明顯，在退化期30 d時(shí)達(dá)到最高，在妊娠2個(gè)月時(shí)最低；葡萄糖-6-磷酸脫氫酶表達(dá)活性在各個(gè)時(shí)期變化量較明顯，在泌乳7 d時(shí)最高，在妊娠2個(gè)月時(shí)最低；異檸檬酸脫氫酶活性在各個(gè)時(shí)期變化量較明顯，在泌乳7 d時(shí)最高，在妊娠4個(gè)月時(shí)最低（見(jiàn)圖1～3）。

圖1 己糖激酶（HK）活性檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Detection results of HK activity

圖2 異檸檬酸脫氫酶（ICDH）活性檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Detection results of ICDH activity

圖3 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-PD)活性檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Detection results of G-6-PD activity

2.2 甘油三酯、葡萄糖、乳糖及β-酪蛋白含量的檢測(cè)結(jié)果

結(jié)果見(jiàn)圖 4～7。

圖4 甘油三酯（TG）含量檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Detection results of TG content assay

甘油三酯含量在各個(gè)時(shí)期變化量不明顯，在圍產(chǎn)前期達(dá)到最高，在妊娠2個(gè)月時(shí)最低；葡萄糖含量在各個(gè)時(shí)期變化量較明顯，在青春期14個(gè)月時(shí)最高，在妊娠期2個(gè)月時(shí)最低；乳糖含量在各個(gè)時(shí)期變化量較明顯，在圍產(chǎn)前期達(dá)到最高，在青春期2個(gè)月時(shí)最低；β-酪蛋白含量在各個(gè)時(shí)期變化量較明顯，在退化3 d時(shí)達(dá)最高，在青春期2個(gè)月時(shí)最低。

圖5 葡萄糖（Glu）含量檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Detection results of Glu content assay

圖6 乳糖（LAC）含量檢測(cè)結(jié)果Fig.6 Detection results of LAC content

圖7 酪蛋白（β-casein）含量檢測(cè)結(jié)果Fig.7 Detection results of β-casein content

2.3 ATP酶活性的檢測(cè)結(jié)果

Na+K+-ATP酶活性在各個(gè)時(shí)期變化量不明顯，在泌乳280 d時(shí)最高，在妊娠2個(gè)月時(shí)最低；Ca2+Mg2+-ATP酶活性在各個(gè)時(shí)期變化量不明顯，在泌乳140 d最高，在青春期2個(gè)月時(shí)最低（見(jiàn)圖8）。

圖8 ATP酶活性檢測(cè)結(jié)果Fig.8 Detection results of ATPase activity

2.4 能荷值和NADPH含量的檢測(cè)結(jié)果

組織能荷值在各個(gè)時(shí)期變化量不明顯，在圍產(chǎn)前期最高，在泌乳140 d時(shí)最低；NADPH含量在各個(gè)時(shí)期變化量不明顯，在妊娠4個(gè)月時(shí)最高，在青春期14個(gè)月時(shí)最低（見(jiàn)圖9、10）。

圖9 能荷含量檢測(cè)結(jié)果Fig.9 Detection results of Energy charge content

圖10 NADPH含量檢測(cè)結(jié)果Fig.10 Detection results of NADPH content

3 討論

3.1 青春期奶牛乳腺能量代謝變化規(guī)律

青春期乳腺導(dǎo)管和腺泡上皮細(xì)胞較少，主要為不規(guī)則的脂肪和結(jié)締組織。此時(shí)期乳腺組織發(fā)育較慢，能量代謝并不旺盛，因此目前還沒(méi)有對(duì)青春期奶牛乳腺能量代謝規(guī)律的系統(tǒng)研究。本研究通過(guò)對(duì)乳腺發(fā)育青春2個(gè)月、青春12個(gè)月至青春14個(gè)月這一階段的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶ICDH的活性在這一階段沒(méi)有顯著變化，而糖酵解途徑的關(guān)鍵酶HK和磷酸戊糖途徑的關(guān)鍵酶G-6-PD的活性呈現(xiàn)出增長(zhǎng)的趨勢(shì)，結(jié)合青春期階段奶牛乳腺組織中的葡萄糖濃度高于妊娠期和泌乳期，推測(cè)可能與其作為相對(duì)單一的糖代謝主要物質(zhì)有關(guān)，也可能是與其代謝消耗較少有關(guān)。

3.2 妊娠期奶牛乳腺能量代謝變化規(guī)律

妊娠期乳腺進(jìn)一步發(fā)育，妊娠中期，合成乳糖和乳脂所需的酶開(kāi)始出現(xiàn)[9]，妊娠晚期，在組織結(jié)構(gòu)上接近于泌乳的乳腺。大量研究表明，妊娠期的乳腺發(fā)育決定了泌乳期分泌細(xì)胞的數(shù)量和后續(xù)的產(chǎn)乳能力[10]。NADPH常常存在于糖類(lèi)代謝過(guò)程中。結(jié)果顯示P4M的NADPH最高，這可能是與乳腺快速發(fā)育所需的生物還原力有關(guān)。此時(shí)期物質(zhì)和能量代謝逐漸旺盛。這與周貴等的報(bào)道相一致[11]。

3.3 圍產(chǎn)前期奶牛乳腺能量代謝變化規(guī)律

圍產(chǎn)期是奶牛整個(gè)的泌乳周期中最至關(guān)重要的一個(gè)時(shí)期，在這個(gè)階段，奶牛經(jīng)歷了巨大的生理與代謝變化，抵抗力較差，故發(fā)病率要比泌乳中、后期均高，此時(shí)期奶牛亦需要大量能量。此時(shí)期甘油三酯、乳糖濃度和能荷較高。能荷是動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)細(xì)胞能量平衡的一個(gè)參數(shù)[12]，也是含高能磷酸鍵的腺苷的比值，其作為測(cè)定細(xì)胞高能磷酸狀態(tài)的指標(biāo)，可有效評(píng)估組織細(xì)胞的能量?jī)?chǔ)備狀態(tài)。此時(shí)其脂肪動(dòng)員減弱，這與張光軍的報(bào)道相一致[13]，而本試驗(yàn)亦測(cè)得此時(shí)期甘油三酯濃度較高。這一時(shí)期主要進(jìn)行物質(zhì)和能量貯備。能量貯備和攝食的調(diào)節(jié)與脂肪狀態(tài)調(diào)節(jié)食欲的理論相一致[14]，表明在奶牛的圍產(chǎn)期，能量的儲(chǔ)備與防止產(chǎn)后能量負(fù)平衡有密切關(guān)系。另有研究表明，圍產(chǎn)期增加能量攝入，對(duì)奶牛健康、泌乳及高產(chǎn)奶牛的再生產(chǎn)性能有積極作用[15]。

3.4 泌乳期奶牛乳腺能量代謝變化規(guī)律

泌乳期乳腺的發(fā)育達(dá)到頂峰，泌乳初期ICDH活性和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性較高，說(shuō)明此時(shí)期代謝旺盛，主要進(jìn)行磷酸戊糖途徑和三羧酸循環(huán)，提示泌乳期補(bǔ)充磷酸戊糖途徑和三羧酸循環(huán)途徑底物如葡萄糖等糖類(lèi)物質(zhì)及脂類(lèi)等物質(zhì)的重要性。這與劉國(guó)文等報(bào)道的高產(chǎn)奶牛在泌乳前幾周常存在能量負(fù)平衡[16]，此時(shí)母牛處于酮病和脂肪肝的危險(xiǎn)期相一致，隨著泌乳期的延長(zhǎng)，能荷和ICDH活性降低，供能分解代謝能力下降。提示應(yīng)加強(qiáng)能量基礎(chǔ)物質(zhì)補(bǔ)充。

3.5 退化期奶牛乳腺能量代謝變化規(guī)律

斷乳后，乳腺便停止分泌活動(dòng)，進(jìn)入退化期，腺泡上皮細(xì)胞開(kāi)始凋亡。Mazurek等研究了小鼠乳腺退化時(shí)期的能量代謝情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)磷酸戊糖和糖異生途徑的酶活性在乳腺組織退化的前期降低，同時(shí) ATP、GTP、UTP、ADP、NAD、NADH和乳酸含量減少[4]。而糖酵解途徑的關(guān)鍵酶磷酸果糖激酶在乳腺退化的前期其活性仍保持較高的水平。本研究對(duì)奶牛乳腺退化初期代謝途徑的關(guān)激酶活性進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HK作為糖酵解途徑的另一個(gè)關(guān)鍵酶，其在奶牛乳腺退化期高活性水平與小鼠乳腺的研究結(jié)果具有相似性，推測(cè)其可能與這一時(shí)期乳腺組織重建對(duì)分解代謝的能量與物質(zhì)需求有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究對(duì)乳腺組織中己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶、甘油三酯、葡萄糖、乳糖、β-酪蛋白、ATP酶、能荷值和NADPH等指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明，青春期14個(gè)月時(shí)葡萄糖濃度最高，妊娠4個(gè)月時(shí)NADPH含量最高，圍產(chǎn)前期時(shí)甘油三酯含量、乳糖含量和能荷值最高，泌乳7 d時(shí)異檸檬酸脫氫酶活性和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性最高，泌乳140 d時(shí)的Ca2+Mg2+-ATP酶的活性最高，泌乳280 d時(shí)的Na+K+-ATP酶活性最高，退化期3 d β-酪蛋白含量最高，退化期30 d時(shí)的己糖激酶活性最高。從而揭示了奶牛乳腺不同發(fā)育時(shí)期能量代謝的規(guī)律。

[1]Duske K,Hammon H M,Langhof A K,et al.Metabolism and lactation performance in dairy cows fed a diet containing rumen-protected fat during the last twelve weeks of gestation[J].J Dairy Sci,2009,92(4)∶1670-1684.

[2]Krizsan S J,Broderick G A,Muck R E,et al.Effect of alfalfa silage storage structure and roasting corn on production and ruminal metabolism of lactating dairy cows[J].J Dairy Sci,2007,90(10)∶4793-4804.

[3]Raggio G,Lemosquet S,Lobley G E,et al.Effect of casein and propionate supply on mammary protein metabolism in lactating dairy cows[J].J Dairy Sci,2006,89(11)∶4340-4351.

[4]Mazurek S,Weisse G,Wüst G,et al.Energy metabolism in the involuting mammary gland[J].In vivo,1999,13(6)∶467-77.

[5]Rudolph M C,Mc Manaman J L,Phang T L,et al.Metabolic regulation in the lactating mammary gland∶a lipid synthesizing machine[J].Physiol Genomics,2007,28∶323-336.

[6]陳建暉,佟慧麗,李慶章,等.胰島素催乳素和孕酮對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞泌乳功能的影響[J].中國(guó)奶牛,2008(8)∶9-13.

[7]佟慧麗,高學(xué)軍,李慶章,等.胰島素、催乳素對(duì)奶山羊乳腺上皮細(xì)胞泌乳功能的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2008,39(6)∶721-725.

[8]洪平,劉虎威,靳光華,等.高效液相色譜法測(cè)定骨骼肌ATP、ADP、AMP、NAD+、NADH含量[J].中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志,2002,21(1)∶57-60.

[9]Mather I H,Keenan T W.Origin and secretion of milk lipids[J].J Mammary Gland Biol Neoplasia,1998,3(3)∶259-273.

[10]Ji F,Hurl E Y W L,Kim S W.Characterization of mammary gland development in pregnant gilts[J].J Anim Sci,2006,84(3)∶579-587.

[11]周貴,李文波.妊娠和圍產(chǎn)期奶牛的飼養(yǎng)管理[J].吉林畜牧獸醫(yī),2008(8)∶37-38.

[12]Manfredi G,Yang L,Gajewski C D,et al.Measurements of ATP in mammalian cells[J].Methods,2002,26∶317-326.

[13]張輝.脂聯(lián)素對(duì)圍產(chǎn)期奶牛脂肪動(dòng)員的調(diào)控作用[D].長(zhǎng)春∶吉林大學(xué),2007∶76-99.

[14]李艷飛,李紅梅,牛淑玲,等.不同能量水平對(duì)圍產(chǎn)期奶牛脂肪動(dòng)員的影響[J].中國(guó)奶牛,2005(5)∶7-9.

[15]Curtis C R,Erb H N,Sniffen C J,et al.Path analysis of dry period nutrition,postpartum metabolic and reproductive disorders,and mastitis in Holstein cows[J].J Dairy Sci,1985,68∶2347-2360.

[16]劉國(guó)文,王哲.圍產(chǎn)期奶牛能量代謝障礙性疾病的研究進(jìn)展[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2004(8)∶78-79.