王亞賓,胡清林,陳麗穎,程金平,陳小麗,崔保安

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院,河南鄭州450002)

腸球菌是一種重要的條件致病菌[1]。近年來(lái),由于腸球菌感染動(dòng)物報(bào)道不斷增多[2-10],尤其是耐藥性的不斷增加[11-12],該細(xì)菌逐漸引起人們的重視。以前的研究發(fā)現(xiàn)豬感染糞腸球菌主要引起敗血癥,但國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)有引起關(guān)節(jié)炎的報(bào)道。2008年10月,我們接檢了河南洛陽(yáng)送檢的一頭仔豬,病豬除了跗關(guān)節(jié)腫大外,飲食、精神狀況和體溫等均未見(jiàn)異常,剖開(kāi)患豬的發(fā)病關(guān)節(jié),可見(jiàn)有多量的稀薄膿液。經(jīng)細(xì)菌分離純化、生化特性鑒定及16 S rRNA序列測(cè)定,最終確定為糞腸球菌感染,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株

臨床分離株為2008年10月河南洛陽(yáng)送檢的一例關(guān)節(jié)腫大的病豬,無(wú)菌采取其關(guān)節(jié)液分離純化后,命名為HE43。糞腸球菌參考菌株ATCC29212、ATCC33186和CMCC(B)32223均由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司惠贈(zèng),所有菌株加入50%甘油后由本實(shí)驗(yàn)室于—70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要儀器和試劑

Vitek-32全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)、革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌鑒定卡(GPI;生產(chǎn)批號(hào):B56K),均為法國(guó)生物梅里埃中國(guó)有限公司產(chǎn)品。PCR儀:Bio-rad:PTC—200型擴(kuò)增儀;DYY-6C型電泳儀,北京市六一儀器廠產(chǎn)品。溶菌酶購(gòu)自上海伯奧生物科技有限公司;2×PCR TaqMix購(gòu)自北京美萊博醫(yī)學(xué)科技有限公司;pTG19-T載體購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司;膠回收試劑盒、Proteinase K、瓊脂糖、X-gal、IPTG、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和DNA Marker均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)購(gòu)自瑞興科技有限公司;基因工程菌E.coli DH5α由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保存。胰蛋白胨大豆肉湯(TSB;生產(chǎn)批號(hào)200704038)、腦心萃取液態(tài)培養(yǎng)基(BHI;生產(chǎn)批號(hào):200704102),均系廣東環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品,均按說(shuō)明書(shū)配制;胰蛋白胨大豆鮮血瓊脂平板,按5%的鮮血量加入到胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基自配而成。

1.3 藥敏紙片

青霉素(10單位/片)、氨芐西林(10 μ g/片)、紅霉素(15 μ g/片)、諾氟沙星(10 μ g/片)、萬(wàn)古霉素(30 μ g/片)、替考拉寧(30 μ g/片)、卡那霉素(30 μ g/片)、四環(huán)素(30μ g/片)、頭孢噻肟(30 μ g/片)、利富平(5 μ g/片)、左氟沙星(5 μ g/片)、呋喃妥因(300 μ g/片)、先鋒霉素V(30 μ g/片)、新霉素(30 μ g/片)、強(qiáng)力霉素(30 μ g/片)、氯霉素(30 μ g/片)、丙氟哌酸(5 μ g/片)、多黏菌素B(300單位/片)、磷霉素(200μ g/片)、鏈霉素(300 μ g/片)、慶大霉素(120 μ g/片),系杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品。

1.4 細(xì)菌特性觀察

無(wú)菌取病豬的關(guān)節(jié)液直接接種于普通瓊脂平板和腦心萃取液瓊脂平板,37℃溫箱微厭氧培養(yǎng)24 h。同時(shí)取病關(guān)節(jié)液和瓊脂平板上培養(yǎng)的細(xì)菌典型菌落涂片,革蘭染色后鏡檢。細(xì)菌純化后,接種6.5%NaCl肉湯、pH9.6肉湯,觀察其耐鹽和耐酸堿度情況;并同時(shí)將純培養(yǎng)物培養(yǎng)于10℃、45℃和60℃30 min的條件下,觀察對(duì)溫度的敏感情況。

1.5 溶血和明膠溶解試驗(yàn)

將分離純化的各菌株分別劃線接種于50 mL/L兔鮮血平板上,37℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。明膠溶解試驗(yàn):將各菌株點(diǎn)種在30 g/L的明膠瓊脂平板上,35℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。

1.6 Vitek-32全自動(dòng)生化鑒定

取保存菌種接種到BHI中增菌培養(yǎng)后,再接種到BHIA平板上,經(jīng)24 h培養(yǎng)后挑取典型菌落用4.5 g/LNaCl滅菌鹽水配制成0.6～0.7麥?zhǔn)蠁挝?利用負(fù)壓進(jìn)樣到革蘭陽(yáng)性細(xì)菌鑒定卡中,并放入Vitek-32全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)的孵化箱中,進(jìn)行鑒定。

1.7 藥敏試驗(yàn)

采用紙片擴(kuò)散法。將各菌株接種于TSA瓊脂平板,37℃培養(yǎng)18 h,然后用4.5 g/L的鹽水沖洗TSA瓊脂平板上的純培養(yǎng)菌落,并調(diào)整濁度到0.5麥?zhǔn)蠁挝?。用無(wú)菌棉拭子蘸取菌液,在管壁上擠壓去掉多余菌液。用棉拭子涂布整個(gè)BHIA培養(yǎng)基表面,待菌液稍干燥后,將藥敏制片緊貼平板表面,每個(gè)平板5張藥敏片,37℃培養(yǎng)24 h,觀察結(jié)果。

1.8 16 S rRNA基因的PCR擴(kuò)增與測(cè)序

參照文獻(xiàn)[13-14]設(shè)計(jì)通用引物,正向引物F為5′-CCGAAT TCGTCGACAACAGAGT TTGATCATGGCTCAG-3′,反向引物R為5′-CCC GGGATCCAAGCTTACGGT TACCT TGTTACGACTT-3′,其中正向引物F含有EcoRⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn),反向引物R含有BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn),預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段為1 500 bp。PCR反應(yīng)按照Messick[15]的方法進(jìn)行,反應(yīng)體系的總體積為50 μ L(2×PCR TaqMix 10 μ L(0.2U Taq DNA Polymerase/μ L;400 μ mol/L dNTP each;20 mmol/L T ris-HCl,pH8.7;100 mmol/L KCl;3 mmol/L MgCl2);正向、反向引物(20 pmol/μ L)各1 μ L;模板DNA 5 μ L,最后補(bǔ)充雙蒸去離子水至50 μ L)。擴(kuò)增程序如下:95℃預(yù)變性5 min;94℃30 s,54℃30 s,72℃2 min,35個(gè)循環(huán);最后于72℃延伸10 min。用蒸餾水作為陰性對(duì)照。取10 μ L PCR產(chǎn)物,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段。

16 S rRNA擴(kuò)增產(chǎn)物用pTG19-T載體連接,轉(zhuǎn)化E.coli DH5α后,由北京博尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序,測(cè)定的DNA序列以雙鏈堿基互補(bǔ)的結(jié)果為準(zhǔn)。測(cè)得的分離株16 S rRNA序列在NCBI上進(jìn)行BLAST后,并同時(shí)與3株標(biāo)準(zhǔn)株和GenBank中已登陸的相關(guān)菌株的16 S rRNA基因序列進(jìn)行同源性比較,采用基因分析軟件DNAStar Version 5.0中的MegAlign進(jìn)行同源性比較并繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1.9 仔豬的感染試驗(yàn)

試驗(yàn)仔豬購(gòu)自鄭州市某規(guī)模化豬場(chǎng)20日齡的6頭健康仔豬,購(gòu)回后隨機(jī)分成2組,分別用于HE43的攻毒和對(duì)照試驗(yàn)。所有仔豬按要求進(jìn)行飼養(yǎng),經(jīng)觀察正常后進(jìn)行試驗(yàn)。HE43分離菌首先接種兔鮮血平板,37℃24 h培養(yǎng)后,4℃條件下離心制成5×1010cfu/mL的菌液,用滅菌生理鹽水稀釋成1×1010cfu/mL濃度的菌液后,每只仔豬耳靜脈注射3 mL,對(duì)照組注射3 mL的滅菌生理鹽水

2 結(jié)果

2.1 分離菌的形態(tài)與培養(yǎng)特性

分離菌為卵圓形、G+,單個(gè)、成對(duì)或鏈狀排列。關(guān)節(jié)液直接涂片鏡檢可見(jiàn)分離菌形態(tài)較小,鏈較長(zhǎng),可達(dá)20個(gè)～30個(gè);而分離菌經(jīng)培養(yǎng)后則形態(tài)較大,一般呈短鏈狀,鏈的長(zhǎng)度多為3個(gè)～4個(gè)。分離菌在BHIA瓊脂平板上生長(zhǎng)良好,37℃培養(yǎng)24 h即能長(zhǎng)出灰白色、不透明、圓形、微凸、濕潤(rùn)、表面光滑、邊緣整齊的露珠狀小菌落,直徑1.5 mm～2 mm;在普通瓊脂平板上生長(zhǎng)貧瘠,24 h后僅長(zhǎng)出有針尖大小的菌落。分離菌可在65 g/L NaCl、pH 9.6的肉湯中以及10℃、45℃條件下生長(zhǎng),并可以耐受60℃、30 min的極端環(huán)境條件。

2.2 溶血和明膠溶解結(jié)果

分離株在30 g/L的明膠瓊脂平板上35℃24 h培養(yǎng),菌落周圍均可以形成清楚的暈環(huán)。在兔血瓊脂平板上,細(xì)菌可以溶解兔紅細(xì)胞,并呈現(xiàn)α型溶血。

2.3 Vitek-32生化鑒定結(jié)果

分離菌經(jīng)Vitek-32全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)鑒定為糞腸球菌(E.faecalis),具體結(jié)果詳見(jiàn)表1。

表1 分離菌株的Vitek-32全自動(dòng)生化鑒定結(jié)果Table 1 The biochemical properties of the isolates identified by Vitek-32 automated sy stem

2.4 藥敏試驗(yàn)

分離株的藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。藥敏結(jié)果按美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI,2006)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷。其中,卡那霉素判斷標(biāo)準(zhǔn)參照紅霉素,頭孢唑林和頭孢噻肟參照青霉素的標(biāo)準(zhǔn)。在21種臨床常用藥物中(氯霉素在獸醫(yī)臨床上已禁用,本次主要是根據(jù)CLSI建議做敏感性分析使用),分離株對(duì)包括萬(wàn)古霉素和替考拉寧在內(nèi)的13種藥物敏感,但對(duì)包括四環(huán)素、紅霉素和卡那霉素在內(nèi)的7種藥物產(chǎn)生了耐藥性。慶大霉素和鏈霉素高水平耐藥現(xiàn)象雖未出現(xiàn),但分離株對(duì)鏈霉素藥物敏感性為中等。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of drug sensitivity test

2.5 分離株16 S rRNA擴(kuò)增和酶切鑒定

分離株及3株糞腸球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株16 S rRNA基因PCR擴(kuò)增及酶切鑒定結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2。圖1中可見(jiàn)分離株及3株標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA均擴(kuò)增到1 500 bp左右的16 S rRNA基因片段,與預(yù)期片段大小相符;圖2中顯示的是重組質(zhì)粒BamHⅠ結(jié)果。

2.6 同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

分離菌16S rRNA序列在GenBank中進(jìn)行BLAST,結(jié)果分離菌與3株標(biāo)準(zhǔn)菌株和GenBank中登陸的糞腸球菌的16S rRNA序列同源性均在99.5%～100%之間,提取GenBank中部分糞腸球菌及與糞腸球菌生化分群在一群的相關(guān)腸球菌和3株糞腸球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株16 S rRNA基因序列與分離菌構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3),可見(jiàn)分離菌與GenBank中糞腸球菌和3株標(biāo)準(zhǔn)菌株同在一分支中,而與同群(生化分群)其他菌株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖1 分離菌及3株標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)CR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of 16 S rRNA of the isolates and 3 standard strains

圖2 分離菌和3株標(biāo)準(zhǔn)菌株重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果Fig.2 Recombinant plasmid identification results of 16 S rRNA of the isolates and 3 standard strains

2.7 仔豬的感染試驗(yàn)

仔豬接種后,于第6天開(kāi)始出現(xiàn)食欲減少,精神沉郁,呼吸困難,體溫高達(dá)40.5℃～41℃,站立不穩(wěn),左后側(cè)跗關(guān)節(jié)處手感稍熱。至發(fā)病后第4天,未見(jiàn)試驗(yàn)豬死亡,隨機(jī)將一頭試驗(yàn)豬剖檢,可見(jiàn)肝、腎、脾及淋巴結(jié)腫大、出血,左后側(cè)跗關(guān)節(jié)有多量稀薄滲出液。從剖檢豬關(guān)節(jié)滲出液和各實(shí)質(zhì)臟器中均分離到了與接種菌一致的細(xì)菌。

3 討論

本次從送檢病豬的腫大的關(guān)節(jié)液中分離的一株菌株通過(guò)細(xì)菌涂片染色鏡檢、培養(yǎng)特性和耐性實(shí)驗(yàn)結(jié)果,均符合腸球菌的生理特征[16],經(jīng)過(guò)Vitek-32生化試驗(yàn)鑒定和16 S rRNA基因序列分析證實(shí)該起仔豬關(guān)節(jié)炎是由糞腸球菌(E.faecalis)引起的。

16 S rRNA基因序列已被用作分子鐘(molecular clock)來(lái)評(píng)估細(xì)菌間的相關(guān)性及鑒定未知細(xì)菌到屬和種水平的手段[17],Vitek-32在鑒定非人源糞腸球菌中具有較高的準(zhǔn)確性[18]。本次測(cè)定的分離株的16 S rRNA基因序列在NCBI上進(jìn)行BLAST,其與NCBI上登載的糞腸球菌16S rRNA的序列同源性均在99%以上,包括ATCC29212在內(nèi)的4株腸球菌通過(guò)16 S rRNA基因序列分析全部鑒定到種的水平,其中糞腸球菌分離株與3株標(biāo)準(zhǔn)菌株以及與GenBank公布的糞腸球菌序列同源性均在99.5%～100%之間。但在Vitek-32生化試驗(yàn)中,分離株與以前從感染豬內(nèi)臟中分離的其他糞腸球菌對(duì)棉子糖、蔗糖、松三糖、乳糖和淀粉等反應(yīng)結(jié)果不一致。

圖3 16 S rRNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of 16 S rRNA sequence

腸球菌具有天然耐藥和獲得性耐藥的能力,其對(duì)外界環(huán)境具有的較高抵抗能力和對(duì)藥物的耐藥性能力使其獲得了在各種環(huán)境中較高的生存能力[19]。根據(jù)對(duì)21種臨床藥物的敏感性試驗(yàn),分離株對(duì)7種藥物產(chǎn)生了耐藥性,但值得注意的是本分離株對(duì)同一類藥物的耐藥性也不相同,如對(duì)β-內(nèi)酰胺類青霉素耐藥,但對(duì)氨芐青霉素敏感;對(duì)四環(huán)素類的四環(huán)素耐藥,但對(duì)強(qiáng)力霉素敏感;對(duì)氟喹諾酮類的諾氟沙星耐藥,對(duì)左氟沙星和丙氟哌酸敏感等。因此,臨床上治療腸球菌感染時(shí)一定要進(jìn)行藥物的敏感性試驗(yàn),以確定最佳治療藥物和避免更多的藥物耐受性菌株產(chǎn)生。

腸球菌為一種重要的機(jī)會(huì)致病菌,主要存在于人和動(dòng)物的腸道中。近幾年來(lái),由于免疫抑制性病毒如PRRSV和PCV-2感染的廣泛性和抗生素使用的頻繁性,使得腸球菌感染的機(jī)會(huì)逐漸增多。但以往報(bào)道糞腸球菌主要引起感染仔豬的敗血癥[20],未見(jiàn)引起關(guān)節(jié)炎的病例,本次引起仔豬關(guān)節(jié)炎的糞腸球菌的致病機(jī)理以及它的流行病學(xué)有關(guān)知識(shí)還有待于進(jìn)一步研究。

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