孫永科,楊林富,楊亮宇,畢保良,初曉輝,楊玉艾

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,云南昆明650201)

長期和廣泛的使用抗生素不僅造成病原微生物產(chǎn)生耐藥性,并且還帶來毒副作用、污染環(huán)境以及影響畜產(chǎn)品品質(zhì)等諸多弊端[1]。中草藥具有較好的防治疫病的效果,并具有成本低,殘留少,毒副作用小等優(yōu)點[2],運用中草藥進(jìn)行防治疾病有相當(dāng)大的潛力。板栗花為殼斗科(Fagceae)栗屬植物栗(Castanea mollissima Blume)的雄性花序[3],可以增強(qiáng)血管張力,降低血管脆性,改善血管通透性,降低血脂及膽固醇;減少紅血球和血小板聚集,減少血栓的形成[4];護(hù)肝解毒,提高機(jī)體免疫力;抗菌、抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗真菌、抑制腫瘤[5]等。近年來,隨著板栗種植面積的擴(kuò)大,板栗雄花日益增多,成為板栗生產(chǎn)中的廢棄物,造成極大的資源浪費。本試驗通過板栗花提取物的體外抑菌試驗,進(jìn)一步明確板栗花的抑菌活性,以期能夠變廢為寶,為云南省板栗花的進(jìn)一步研究與開發(fā)應(yīng)用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 板栗花 采自云南省昆明市嵩明縣板栗園。

1.1.2 供試菌株 大腸埃希菌O4、大腸埃希菌O8、大腸埃希菌O101、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌等均由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院微生物實驗室保存。

1.1.3 供試菌株培養(yǎng)基、含藥平板和藥敏片 由本研究小組參照常規(guī)方法[7]制備。

1.2 方法

1.2.1 中藥板栗花提取物的制備 采用水提取法提取,稱取150 g板栗花細(xì)粉,加入5倍～6倍量蒸餾水,浸泡18 h后,煎煮1.5 h～2 h,過濾收集藥液,藥渣加3倍～4倍量蒸餾水煎煮1.5 h～2 h,再過濾收集藥液,最后,藥渣再加3倍～4倍量蒸餾水煎煮1 h,過濾收集藥液。將三次濾液合并進(jìn)行濃縮,至其生藥量為1 g/mL時,于121℃滅菌15 min～20 min后備用[6]。

1.2.2 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的制備根據(jù)常規(guī)方法[7]制備。

1.2.3 含藥平板的制備 在普通瓊脂培養(yǎng)基中加入終濃度分別為:C1=0.001 g/mL C2=0.01 g/mL C3=0.1 g/mL C4=1 g/mL的板栗花提取物。制備方法同1.2.2。

1.2.4 藥敏片的制備

1.2.4.1 藥敏試紙的準(zhǔn)備 用打孔機(jī)將常用的定性濾紙打成直徑為0.5 cm的圓形濾紙片,121℃滅菌20 min,烘干后備用。

1.2.4.2 藥液的準(zhǔn)備 將濃縮后的板栗花提取物分別用滅菌蒸餾水稀釋成C1=0.002 g/mL、C2=0.02 g/mL、C3=0.2 g/mL、C4=0.5 g/mL 4個濃度。

1.2.4.3 藥敏片的制備 將10片藥敏試紙放入0.5 mL的藥液中,待藥液充分吸收后置于37℃～40℃恒溫箱中干燥,密封后4℃保存。所得4種濃度的藥敏片分別為C1=0.000 1 g/mL、C2=0.001 g/mL、C3=0.01 g/mL和C4=0.025 g/mL。1.2.5 細(xì)菌懸液的制備及細(xì)菌平板計數(shù) 將供試菌株接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基[8]中,37℃培養(yǎng)18 h～24 h后,按10倍稀釋制備的10—4、10—5、10—6懸液,分別吸取0.1 mL分別滴入固體培養(yǎng)基中,均勻涂布后于37℃培養(yǎng)18 h～24 h[9],觀察并記錄結(jié)果。

1.2.6 藥敏試驗

1.2.6.1 含藥平板藥敏試驗 根據(jù)平板計數(shù)結(jié)果,取最適濃度菌液0.1 mL滴入不同梯度含藥平板中,均勻涂布后于37℃培養(yǎng)18 h～24 h,觀察細(xì)菌生長情況。有細(xì)菌生長判為陰性,記為“—”;無細(xì)菌生長判為陽性,記為“+”。

1.2.6.2 藥敏片藥敏試驗 根據(jù)平板計數(shù)結(jié)果,取最適濃度的菌液0.1 mL滴入制備好的瓊脂培養(yǎng)基中,均勻涂布,然后貼上不同梯度的藥敏片,每個梯度5片,3個重復(fù),于37℃培養(yǎng)18 h～24 h后,測量藥敏片抑菌圈大小。抑菌圈直徑＜10 mm為低度敏感,10 mm＜抑菌圈直徑為＜15 mm為中度敏感,抑菌圈直徑＞15 mm為高度敏感[10]。

2 結(jié)果

2.1 最適制作含菌平板的菌液濃度

根據(jù)細(xì)菌平板計數(shù)的結(jié)果,確定本試驗中各種供試菌的最佳濃度,大腸埃希菌O4為10—3個/mL,大腸埃希菌O8、大腸埃希菌O101、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌均為10—4個/mL。

2.2 含藥平板藥敏試驗結(jié)果

不同濃度的板栗花平板抑菌顯示,空白和C1=0.001 g/mL濃度的平板對所有試驗菌株沒有抑制作用,C2=0.01 g/mL、C3=0.1 g/mL和C4=1 g/mL均有明顯的抑菌作用。結(jié)果如表1。

表1 含藥平板抑菌效果Table 1 Antibacterial effect of the medicated plate

2.3 藥敏片藥敏試驗結(jié)果

不同梯度的藥敏片對不同受試菌的抑菌圈大小顯示,C3=0.01 g/mL和C4=0.025 g/mL兩種濃度對大腸埃希菌O4、大腸埃希菌O8、大腸埃希菌O101、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌都高度敏感(結(jié)果見表2)。

表2 藥敏片抑菌效果Table 2 Antibacterial effect of sensitive tablets

3 討論

中草藥是我國醫(yī)藥領(lǐng)域的天然寶庫,也是世界藥品資源的重要組成部分。近年來,因為化學(xué)藥物和抗生素的過量使用,引起藥物殘留和細(xì)菌耐藥性問題日益嚴(yán)重,而中草藥作為一種天然藥物,有巨大的開發(fā)潛力[11]。但是我國獸用中草藥的開發(fā)相對落后,難以找到讓人滿意的新藥,因此,應(yīng)加強(qiáng)對民間常用藥物的關(guān)注,以求開發(fā)出更新更有效的抗菌藥物。

從本試驗研究結(jié)果看出,板栗花提取物的濃縮液對細(xì)菌的抑制效果明顯,被抑制的細(xì)菌中既有革蘭陽性菌,也有革蘭陰性菌;既有球菌也有桿菌,說明板栗花提取物對細(xì)菌具有廣泛抑制作用。

從藥敏試驗結(jié)果可看出,較低濃度的板栗花提取物即可抑制細(xì)菌的生長,大部分細(xì)菌對板栗花提取物較低濃度(0.01 g/mL)即表現(xiàn)為高度敏感,證明板栗花提取物具有較好的抑菌作用。

對于藥物殘留和細(xì)菌耐藥性問題,除開發(fā)研究新的低殘留的抗菌藥物外,更應(yīng)控制和杜絕濫用抗生素的現(xiàn)象?？股氐臑E用不僅促使了一些耐藥和變異的超級細(xì)菌的產(chǎn)生,增加了不良反應(yīng)的發(fā)生幾率,并且造成了資源浪費[12]?？梢詮暮侠碛盟?規(guī)范獸藥市場,加強(qiáng)市場監(jiān)督管理,提高獸醫(yī)人員的業(yè)務(wù)素質(zhì)等方面改善和減少獸用抗生素的濫用。

查尋相關(guān)資料沒有發(fā)現(xiàn)板栗花不良反應(yīng)的報道,板栗花在機(jī)體內(nèi)抑菌作用和配伍禁忌有待于進(jìn)一步研究。

從藥敏試驗結(jié)果可看出,大部分的大腸埃希菌對板栗花提取物較低濃度(0.01 g/mL)即表現(xiàn)為高度敏感,在民間獸醫(yī)臨床上應(yīng)用40 g/頭～80 g/頭板栗花對大腸埃希菌引起的仔豬腹瀉進(jìn)行臨床治療,效果比較理想,這也為本課題的下一步的進(jìn)行指明了方向。

[1] 徐鐘鈞.隱匿的冰山:動物抗生素濫用[J].生命世界,2006(6):32-35.

[2] 李劍勇.中獸藥研究開發(fā)的現(xiàn)狀與展望[J].畜禽業(yè),2001(11):10-12.

[3] 王 嗣,杜成林,唐文照,等.板栗花的化學(xué)成分研究(I)[J].中草藥,2004,35(10):1103-1104.

[4] 李時珍,黃志杰,胡永年.本草綱目中藥學(xué)[M].遼寧沈陽:遼寧科學(xué)技術(shù)出版社,2006:449-450.

[5] 王 嗣,唐文照,丁杏苞.板栗花中兩個新黃酮苷類化合物[J].藥學(xué)學(xué)報,2004,39(6):442-444.

[6] 楊林富,項 勛,段綱等.中草藥黃荊提取物體外抑菌試驗[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2005(9):69-69.

[7] 劉旭川,張文鑫,李 梅,等.動物微生物實驗指導(dǎo)[M].云南昆明:云南農(nóng)業(yè)大學(xué),2001:4-6.

[8] 陸承平.獸醫(yī)微生物學(xué)[M].3版.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2001:200-203.

[9] 李秀敏,錢景富,馮艷秋.簡述藥物敏感性試驗的方法[J].吉林畜牧獸醫(yī),2005(5):20-21.

[10] 楊林富,段 綱.獸醫(yī)藥理學(xué)實驗指導(dǎo)[M].云南昆明:云南農(nóng)業(yè)大學(xué),2001:23-27.

[11] 楊志強(qiáng).我國獸藥研究發(fā)展趨勢及應(yīng)對策略[J].動物保健,2005(5):17-18.

[12] 邱家學(xué),李 娜.淺析我國抗生素濫用現(xiàn)狀及危害[J].上海醫(yī)藥,2006,12(27):555-556.