徐守振,尹燕博,郭艷艷

(1.青島農(nóng)業(yè)大學動物科技學院,山東青島266109,2.青島澳蘭百特生物工程有限公司,山東青島266101)

隨著山東省養(yǎng)雞業(yè)的持續(xù)發(fā)展,集約化程度的不斷提高,雞主要疾病的發(fā)生與流行也隨之不斷變化。有關資料表明,傳染病仍是目前危害山東省家禽業(yè)的大敵,約占禽病發(fā)生總數(shù)的75%,尤其是禽流感(H9亞型)、新城疫(ND)和雞傳染性支氣管炎(IB)等病毒性疾病仍然是危害山東省養(yǎng)雞業(yè)發(fā)展的幾種主要傳染病[1]。近年來該幾種病毒病呈現(xiàn)出非典型化、多重感染、混合感染和繼發(fā)感染等特點,給禽病的診斷與防治工作帶來很多困難。

為明確山東省禽流感(H9亞型)、新城疫(ND)和雞傳染性支氣管炎(IB)的分布情況和流行特點,本試驗用采用已建立的RT-PCR診斷技術(shù)對2009年下半年山東膠東主要養(yǎng)雞地區(qū)(濰坊、青島和煙臺)等地送檢的患有呼吸道癥狀的病料進行了3種病毒的感染情況調(diào)查,可為今后有效防制提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 2009年7月—2009年12月,收集送檢的來自山東省三個主要養(yǎng)雞地區(qū)(濰坊、青島和煙臺)規(guī)模化雞場疑似患有呼吸道疾病的自然發(fā)病雞病料,共計774份。

1.1.2 主要試劑 Tis-飽和酚氯仿為國產(chǎn)試劑;TaqDNA聚合酶、dNT Ps、DL 2 000 DNA Marker均購自寶生物工程(大連)有限公司;總RNA抽提試劑T rizol購自Invitrogen公司;M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購自Promega公司;RNase inhibitor購自Toyobo公司。

1.1.3 引物 根據(jù)GeBank已發(fā)表的序列,應用DNAstar和DNAman軟件對NDV的F基因、IBV的S基因和AIV(H9)的HA基因序列進行同源性分析,應用Primer5.0和Oligo6.0軟件對各自保守區(qū)設計引物,通過http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BlasT對其特異性鑒定表明3對引物均具有良好的特異性。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成(見表1)。

表1 PCR引物T able 1 Primers for PCR

1.2 方法

1.2.1 病料的處理 將病料充分勻漿(與PBS 1∶5)后,反復凍融3次～4次,12 000 r/min離心15 min,取上清—20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病毒總RNA的抽提 1.5 mL離心管內(nèi)加入600 μ L T rizol裂解液,后加400 μ L病料,反復顛倒幾次混勻。加入400 μ L氯仿,顛倒混勻,—20℃沉淀10 min。12 000 rpm離心10 min,取上清,再加入800 μ L異丙醇混勻,—20℃沉淀30 min。12 000 rpm離心10 min,棄上清,再加入750 mL/L冷酒精1000 μ L,沖洗1次～2次。晾干后,用無RNase水30 μ L溶解,—70℃凍存?zhèn)溆没蚣从谩?/p>

1.2.3 cDNA的合成(RT) 病毒RNA反轉(zhuǎn)錄反應體系為20 μ L,其中RNA模板4 μ L,5×Buffer 4 μ L,dNTPs(10 mmol/L each)2 μ L,RNase Inhibitor(10 U/μ L)1 μ L,3種病毒基因序列特異的下游引物(25 pmol/μ L)各1 μ L,M-MLV(200 U/μ L)1 μ L,DEPC滅菌水7 μ L,輕輕吹打混勻,1 000 r/min離心1 min,在PCR儀上進行以下循環(huán):42℃60 min,98℃5 min,反應后瞬間離心,反應產(chǎn)物置—20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 目的基因片段的PCR擴增 采用我們山東省預防獸醫(yī)學重點實驗室已建立的PCR反應體系[2]:模板2.0 μ L,10×PCR buffer3.0 μ L,dNTPs(2.5 mmol/L)2.5 μ L,MgCl2(25 mmol/L)4.0 μ L,3種序列的上下游引物(25 pmol/μ L)各0.5 μ L,TaqDNA聚合酶(5 U/μ L)0.5 μ L,加H2O至30 μ L,吹打混勻后瞬時離心。PCR反應參數(shù):94.5℃2 min;94.5℃30 s;55℃40 s;72℃1.5 min,35個循環(huán);72℃再延伸9 min。反應結(jié)束后取5 μ L PCR產(chǎn)物在15 g/L的瓊脂糖凝膠上電泳,在凝膠成像系統(tǒng)上觀察。

2 結(jié)果

2.1 NDV、IBV和AIV(H9)總感染情況

2009年下半年從山東濰坊、青島、煙臺三地區(qū)送檢的774份病料中共有198份至少可檢出NDV、IBV和AIV(H9)中的一種或多種,陽性率為25.58%,其中NDV陽性率為8.14%,IBV陽性率為11.37%,AIV(H9)陽性率為6.07%,說明2009年下半年NDV、IBV和AIV(H9)3種病毒在膠東主要養(yǎng)雞地區(qū)中普遍存在,且3種病毒感染率相當(表2)。

表2 NDV、IBV和AIV(H9)的檢測結(jié)果Table 2 The detection results of NDV,IBV and AIV(H9)

2.2 不同地區(qū)各病毒感染情況

2009年下半年,濰坊地區(qū)共送檢病料142份,NDV、IBV和AIV(H9)的陽性率分別為5.63%、4.93%和14.08%;青島地區(qū)共送檢病料433份,NDV、IBV和AIV(H9)的陽性率分別為12.47%、14.55%和3.23%;煙臺地區(qū)共送檢病料199份,NDV、IBV和AIV(H9)的陽性率分別為0.5%、9.05%和6.53%(表3)。

表3 不同地區(qū)3種病毒的檢出結(jié)果T able 3 The detection results of three viruses in different regions

2.3 不同月份各病毒感染情況

2009年下半年各月份3種病毒感染情況有所不同,7月AIV(H9)陽性率最高為25.58%,10月NDV和IBV陽性率都最高,分別為12.24%和16.33%(表4)?？傮w來看,氣候寒冷月份3種病毒的感染率相對較高,說明3種疾病的發(fā)生與氣溫有一定關系。

表4 不同月份3種病毒的檢出結(jié)果Table 4 The detection results of three viruses in different months

2.4 3種病毒混合感染情況

送檢病料中NDV、IBV和AIV(H9)混合感染的現(xiàn)象比較普遍,二重感染陽性率為2.84%,其中NDV+IBV占2.45%,IBV+AIV(H9)占0.39%,被檢樣品中未發(fā)現(xiàn)有三重感染(表5)。

表5 3種病毒混合感染的檢測結(jié)果T able 5 The detection results of co-infections of three viruses

3 討論

目前,雞病毒病的實驗室診斷方法很多,常用的有病毒分離鑒定、血凝(抑制)試驗、中和試驗、免疫熒光和ELISA等方法,這些方法存在操作技術(shù)復雜,周期較長,特異性低、敏感性差等缺點,不易于大規(guī)模普查,在發(fā)生急性疫情或混合感染、隱性感染時,往往不能獲得滿意的效果[3]。PCR技術(shù)具有敏感性高、特異性好、快速簡便等特點,尤其對微量的樣品或難以用組織培養(yǎng)的方法獲得多量病毒樣品的檢測具有一定的優(yōu)勢,已廣泛用于許多病毒和細菌的快速診斷與流行病學調(diào)查[4]。本次調(diào)查運用建立的PCR技術(shù)對山東濰坊、青島和煙臺地區(qū)的規(guī)模雞場774份病料進行了NDV、IBV和AIV(H9)檢測調(diào)查,結(jié)果表明所建立的PCR技術(shù)具有快速、敏感、特異、穩(wěn)定等特點,用該技術(shù)對這些疾病進行早期診斷、流行病學調(diào)查,可為雞傳染病的防控提供重要依據(jù)。

本此調(diào)查從2009年7月至12月共歷時半年時間,對山東膠東3個主要養(yǎng)雞地區(qū)規(guī)模雞場送檢的774份病例進行了3種病毒感染情況調(diào)查,發(fā)現(xiàn)商業(yè)雞群中該3種病毒性疾病均有不同程度的發(fā)生和流行,總感染率為25.58%,陽性率由高到低依次為IBV、NDV和AIV(H9),與我們在2008年1月至2009年6月期間對該三地區(qū)該三種病毒總感染率為65.76%的調(diào)查結(jié)果有很大差異,尤其是AIV(H9)的感染率由41.10%下降為6.07%,下降趨勢尤其顯著;IBV和NDV的感染率也有所下降,但下降不大[5]。感染率顯著下降的主要原因可能與規(guī)?；B(yǎng)殖場使用免疫效果較好的新、支、流三聯(lián)疫苗有很大關系;另一不可忽視的原因是去年冬天氣候一直較寒冷氣溫不變化不大,降雪較多濕度較大,使AIV(H9)的感染率顯著下降。盡管山東三地區(qū)雞場三種病毒的感染和流行普遍存在,但三地區(qū)不同病毒感染的情況稍有差異,青島地區(qū)NDV和IBV的陽性率均為最高,濰坊地區(qū)AIV(H9)陽性率最高,這可能與各地區(qū)三種疾病既往的流行病史、飼養(yǎng)管理和預防控制等措施密切相關。濰坊、青島和煙臺三地區(qū)在地域上緊密相連,而且交流頻繁有關,但該三種疾病感染是否與地域有直接的關系,還有待進一步研究。2009年下半年各月份三種病毒感染情況有所不同,不同月份3種疾病的發(fā)生和流行稍有差異。9月份和10月份氣候交替頻繁,送檢的病料也最多,三種病毒的陽性率都相對較高,說明寒冷季節(jié)是雞呼吸道疾病的多發(fā)季節(jié)。本試驗調(diào)查結(jié)果初步揭示了ND、IB和AI(H9)是造成山東省膠東地區(qū)當前雞場呼吸道疾病經(jīng)濟損失的主要病因,這為有效預防和控制膠東地區(qū)雞場的主要疫病提供科學依據(jù)。

NDV、IBV和AI(H9)是當前造成規(guī)模雞場的主要疫病,不但可以單一感染,還可以混合感染或繼發(fā)感染[6]。送檢病料中NDV、IBV和AIV(H9)混合感染的現(xiàn)象較普遍,二重感染的陽性率合計達2.58%,NDV+IBV二重感染最為常見,IBV+AIV(H9)也存在。AI和ND能引起雞一定程度的免疫抑制,免疫系統(tǒng)發(fā)育未成熟的雛雞感染后,損傷機體的免疫系統(tǒng),促進了其它病原體的感染力和致病力,造成混合感染的嚴重后果,不但直接影響雞群的生長發(fā)育,加劇病雞的臨床癥狀,提高了發(fā)病率和死亡率,導致致病性細菌繼發(fā)感染,而且使疫苗免疫效果不佳甚至免疫失敗,使雞病更加復雜和嚴重,加大了防控的難度[7-9]。因此,應該針對山東省膠東三地區(qū)3種病毒混合感染流行現(xiàn)狀采取綜合性的防制措施。

[1] 王洪利.2000-2002年山東省雞主要病毒病流行情況調(diào)查[D].江蘇南京:南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院,2004.

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