周玉法,劉敬博,苗增民,蔡玉梅*,李代軍

(1.山東農業(yè)大學動物科技學院,山東泰安271018;2.泰安市岱岳區(qū)畜牧局,山東泰安271000)

魚類腸道中寄生著種類繁多、數量巨大的微生物,它可以幫助消化食物產生一些必需的氨基酸和維生素,對機體的生長有一定的促進作用,并且這些微生物主要是由大量細菌組成的。微生態(tài)學研究表明,環(huán)境條件的改變可導致機體微生態(tài)系統(tǒng)的變化,造成菌群失調,干擾機體營養(yǎng)代謝和免疫功能,甚至嚴重影響機體健康,導致一系列疾病的發(fā)生。因此對腸道菌群結構多樣性進行研究具有至關重要的意義。但是,腸道內微生物很多都是厭氧菌,用傳統(tǒng)的細菌學方法很難對其分析,并且傳統(tǒng)的細菌分離和培養(yǎng)方法耗時、費力,易受操作方法的影響。而分子生物學的發(fā)展為分析腸道菌群的結構帶來了希望。一些分子生物學研究方法,如質粒圖譜、限制性核酸內切酶譜、脈沖場凝膠電泳(PFGE)、隨機引物PCR(RAPD)及ERIC-PCR等,已經被應用于微生物群落的分析與研究,其中,以ERIC序列為基礎的ERIC-PCR指紋圖譜分析是目前應用最廣泛的方法之一,它與其它方法相比,其靈敏度高、可重復性和可靠性好、且省時省力[1]。

腸道細菌中發(fā)現(xiàn)的ERIC序列是一段長為126 bp的反向重復序列,定位于基因組內可轉錄的非編碼區(qū)域或與轉錄有關的區(qū)域,且該序列散布在整個基因組中,具有極強的保守性,用ERIC-PCR得到的DNA條帶特征能反映細菌整個基因組結構的差異,因而能清晰地區(qū)別包含有ERIC重復序列細菌的不同種和不同菌株,具有很強的鑒別種乃至菌株的能力[2]。ERIC-PCR技術已被證明是研究復合菌群結構的有效手段,并已被廣泛應用于各種生物的腸道菌群和環(huán)境復合菌群結構的研究中[3-6]。但采用ERIC-PCR技術研究魚類及其他水生生物的腸道菌群研究結果還未見報道。

本研究采用ERIC-PCR技術對山東省東平湖(山東省第二大淡水湖)常見4種淡水魚(表1)的腸道菌群的組成進行了研究,建立了它們的ERICPCR指紋圖譜并分析了它們之間的相似性,從而為本地區(qū)魚類疾病的防治、微生物類添加劑以及微生態(tài)育種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗用魚

4種健康淡水魚(表1)均采集于東平湖同一水域下的某養(yǎng)殖區(qū)。

表1 山東省東平湖4種常見淡水魚T able 1 four kinds of common fresh water fish from Dongping Lake,Shandong Province

1.2 樣品采集及腸道細菌總DNA的提取

使用無菌的牙簽將腸道劃開,剝取里面的腸道內容物。每種魚收集10個個體的腸道內容物,混合后作為這種魚的代表樣品,置于—20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

用苯酚-氯仿抽提法從魚類腸道樣品中提取基因組DNA,并用100 μ L去離子無菌水溶解,—20℃冷凍保存?zhèn)溆肹7]。

1.3 ERIC-PCR

采用引物ERIC1(3′-CACT TAGGGGTCCTCGAATGTA-5′)和ERIC2(5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′)[8]進行PCR,反應體系由以下成分組成:1.5 U Taq DNA聚合酶,引物ERIC1和ERIC2各300 ng/μ L,0.875 mmol/L dNTPs,1×buffer,1.5 mmol/L MgCl2,2 μ L模板DNA,最后用滅菌雙蒸水補充至25 μ L。反應參數:95℃5 min;94℃1 min,51℃復性1 min,72℃延伸3 min,32個循環(huán);最后72℃延伸16 min,結束反應。進行電泳之前,所有PCR反應產物在4℃條件下保存。PCR擴增產物經12 g/L～15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳分離,以DL 2 000 Maker作為分子質量標準,電泳結果在紫外分析儀(Tanon-2500,Shanghai,China)上照相。

1.4 ERIC-PCR分析

計算機軟件記錄下擴增及電泳譜帶,用電泳圖象分析軟件(Gel Image System,Version 4.00)自動生成矩陣圖。采用非加權對數算術平均法(Unweighted pair group method using averages algorithm,UPGMA),利用NTSYS-pc 2.10軟件構建聚類樹狀圖。

2 結果

2.1 ERIC-PCR指紋圖譜的建立

每一條泳道代表1種魚的腸道菌群ERIC-PCR指紋圖譜(圖1)。因為每條泳道代表的是1種魚10個個體的混合樣品,所以它反映的是這種魚腸道菌群的平均狀態(tài)。不同位置的條帶代表不同的細菌,亮度反映出細菌相對量的多少。從不同泳道的條帶數量、位置和亮度的差異表明4種魚的腸道菌群的結構組成是不一樣的,反映了這些魚的腸道細菌的結構存在明顯的多樣性差異。

圖1 4種魚腸道菌群ERIC-PCR電泳圖Fig.1 ERIC-PCR electrophoresis chart of four kinds of fish

2.2 ERIC-PCR圖譜與腸道細菌組成分析

用ERIC-PCR方法對4種魚腸道菌群進行擴增,得到了每一種魚的腸道菌群聚類樹狀圖,相同種類腸道菌群具有相同的ERIC-PCR指紋圖譜。如圖2所示,樣品1和3的相似性為0.64,說明這兩種魚腸道菌群相似性較高,而樣品2和4相似性較差,且與樣品1和3差異也很大,這很可能與這四種魚的食性和生長的水層有很大關系。

圖2 4種魚腸道菌群ERIC-PCR聚類分析圖Fig.2 ERIC-PCR analysis chart of microfilaria in four fishes

3 討論

已有多篇研究報道魚類腸道菌群的組成和食物有著密切的關系。尹軍霞等[9]用細菌培養(yǎng)和計數的方法對鰱魚、鳊魚、鯽魚等4種不同食性魚的后腸菌群進行了分析后,認為后腸內容物中的細菌總數、后腸內容物和后腸壁中的雙歧桿菌數都與食性相關。曹志華等[10]用稀釋平板計數法對攝食含尿素飼料和對照飼料的健康鯉魚腸道菌群進行了分析,證明攝食含尿素飼料的實驗組能利用尿素的細菌占細菌總數的比例比對照組高了30%。周文豪等[11]對攝食不同餌料的草魚腸道菌群進行研究,證明餌料中的菌群在攝食后48 h內可以影響草魚腸道菌群的數量及組成。由于培養(yǎng)的方法具有較高的選擇性,所以大部分采用培養(yǎng)方法的研究報道主要集中于某幾類細菌的數量變化上。

采用分子生物學技術比較某種魚類或其他水生生物在2種或3種狀態(tài)下(比如不同養(yǎng)殖場或不同飼料)的腸道菌群差別的研究也被報道。如Holben等人研究了養(yǎng)殖型和野生型鮭魚的腸道菌群;Huber W E等[12]研究了不同漁場的虹鱒的腸道菌群;Tanaka R J等[13]研究了不同食物條件下的鮑魚腸道菌群[14]。但是,采用ERIC-PCR方法快速分析多種魚類腸道菌群的差異以及觀察這種差異和食性的關系,還未見報道。本試驗通過ERIC-PCR分析技術對山東東平湖4種常見淡水魚腸道菌群的多樣性進行分析,并通過UPGMA分析了不同食性和腸道菌群多樣性的相關關系。

本研究所采用的樣品全部是來自東平湖同一水域條件下健康成年魚,并且每種魚采用10個個體的混合樣品,這樣降低了食性以外的其他因素包括個體差異對研究結果的影響。雖然在東平湖同一水域條件下,很多影響因素不能得到控制,比如水體表層和底層的環(huán)境是不同的,但是對這4種魚類樣品的研究能夠反映出在同一水域條件下魚類腸道菌群的狀態(tài)。

本研究建立了山東東平湖4種常見淡水魚類在同一水域條件下腸道菌群的ERIC-PCR指紋圖譜,觀察到它們的腸道菌群在同一條件下具有較大差異,并且食性差異大的魚類之間腸道菌群差異也更為明顯。本研究證明,ERIC-PCR技術是一種能夠快速有效地研究魚類腸道菌群的技術,是較其它方法更簡單、靈敏度更高、可重復性和可靠性較好,且能較為全面反映菌群結構多樣性的方法。如果有必要,對ERIC-PCR優(yōu)勢條帶DNA的割膠測序可以進一步確定腸道菌群的優(yōu)勢細菌。

[1] 高衛(wèi)科,王川慶,吳高鋒,等.ERIC-PCR及在腸道菌群分析中的應用[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊,2008(2):52-53.

[2] Hulton C S,Higgins C F,Sharp P M.ERIC sequences:a novel family of repetitive elements in the genomes of Escherichia coli,Salmonella typhimuirum and other enterobacteria[J].Mol Microbiol,1991,5:825-834.

[3] Di Giovanni G D,Watrud L S,Seidler R J,et al.Comparison of parental and transgenic alfalfa rhizosphere acterial communities using Biolog GN metabolic fingerprinting and Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus sequence-PCR(ERIC-PCR)[J].Microbial Ecology,1999,37(2):129-139.

[4] 潘 莉,杜惠敏,黃海東,等.腹瀉兒童腸道菌群結構的ERIC-PCR指紋圖分析[J].中國微生態(tài)學雜志,2003,15(3):141-144.

[5] 魯海峰,魏桂芳,李仲逵,等.ERIC-PCR分子雜交技術分析大熊貓腸道菌群結構[J].中國微生態(tài)學雜志,2005,17(2):81-84.

[6] Wong H C,Lin C H.Evaluation of typing of Vibrio parahaemolyticus by throe PCR methods using special pfimem[J].J Clin Microbiol,2001,39(12):4233-4240.

[7] 金 晶,彭 穎,李曉波.快速提取腸道微生物基因組DNA的方法[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展,2007,7(1):100-103.

[8] Versalovic J,Koeuth T,Lupski J R.Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes[J].Nucleic Acids Res,1991,19(24):6823-6831.

[9] 尹軍霞,沈文英,張建龍,等.不同食性魚腸道壁菌群的研究[J].水利漁業(yè),2003,23(5):7-8.

[10] 曹志華,易萬軍,羅靜波.尿素對鯉魚消化道菌群的影響[J].湖北農學院學報,2001,21(3):226-228.

[11] 周文豪,陳孝煊,張冬曉,等.攝食不同餌料對草魚腸道菌群影響的研究[J].華中農業(yè)大學學報,1998,17(3):252-256.

[12] Holben W E,Williams P,Gilbert M A,et al.Phylogenetic analysis of intestinal microflora indicates a novel Mycoplasma phenotype in farmed and wild salmon[J].Microbiol Ecol,2002,44:175-185.

[13] Huber I,Spanggaard B,Appel K F,et al.Phylogenetic analysis and in situ identification of the intestinal microbial community of rainbow trout(Oncorhynchus mykiss,Walbaum)[J].J Appl Microbiol,2004,96(1):117-132.

[14] T anaka R J,Ootsubo M,Sawabe T,et al.Biodiversity and in situ abundance of gut microflora of abalone(Haliotis discus hannai)determined by culture-independent techniques[J].Aquaculture,2004,241(1-4):453-463.