朱振營(yíng),林祥梅,劉 建*,吳紹強(qiáng),仇松寅,王建武,薛振華

(1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院 動(dòng)植物檢疫研究所,北京100029;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京100193,3.北京市畜牧獸醫(yī)總站,北京100107)

1982年“碩鼠”的問(wèn)世[1],使轉(zhuǎn)基因動(dòng)物成為當(dāng)今生命科學(xué)發(fā)展中的熱門(mén)領(lǐng)域。1997年世界首例體細(xì)胞克隆綿羊“多莉”的誕生,促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因技術(shù)在大動(dòng)物方面的廣泛應(yīng)用。目前國(guó)內(nèi)外已成功研制多種用于生產(chǎn)藥用或食用蛋白、提高瘦肉率、改善營(yíng)養(yǎng)、增強(qiáng)抗病力的轉(zhuǎn)基因豬、牛、羊[3-8]。2006年GTC公司轉(zhuǎn)基因克隆羊生產(chǎn)的藥物抗凝血酶Ⅲ(商品名:ATryn)在歐洲上市,2009年在美國(guó)上市,標(biāo)志著轉(zhuǎn)基因動(dòng)物應(yīng)用正走向產(chǎn)業(yè)化道路。

由于轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品存在風(fēng)險(xiǎn),轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品的管理一直受到各國(guó)政府的高度重視。而建立規(guī)范、準(zhǔn)確、快速的轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)技術(shù),是維護(hù)消費(fèi)者知情同意權(quán)和在國(guó)際貿(mào)易中維護(hù)國(guó)家利益的重要保障。

轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)技術(shù)的研究已開(kāi)展多年,常用的檢測(cè)技術(shù)包括:第一類(lèi)是在整合水平上進(jìn)行的檢測(cè);第二類(lèi)是在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行的檢測(cè);第三類(lèi)是在表達(dá)水平上進(jìn)行的檢測(cè)。國(guó)際上比較認(rèn)同的檢測(cè)技術(shù)是利用PCR方法對(duì)外源基因進(jìn)行整合水平檢測(cè)[8]。

目前對(duì)具有商品化前景的轉(zhuǎn)基因家畜的檢測(cè)平臺(tái)尚待建立,本研究以通過(guò)體細(xì)胞核移植技術(shù)制作的轉(zhuǎn)人血清白蛋白基因的奶牛[7]為研究對(duì)象,針對(duì)內(nèi)源基因B2M、外源基因hLF及標(biāo)記基因EGFP和NptII建立了多重PCR檢測(cè)方法,旨在對(duì)我國(guó)出入境檢驗(yàn)提供技術(shù)支持,為轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)制度在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及其產(chǎn)品中的順利實(shí)施提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)所用轉(zhuǎn)人血清白蛋白基因奶?；蚪M來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試劑

PCR用Taq DNA聚合酶、dNTPs及緩沖液購(gòu)自寶生物工程(大連)有限生物有限公司,pGEM-T載體購(gòu)自Promega公司,瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒、微量質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司。

1.3 引物

根據(jù)序列號(hào)為NM_173893.3的序列設(shè)計(jì)奶?；蚪M內(nèi)源性基因B2M的引物,根據(jù)序列號(hào)為AB049976的序列設(shè)計(jì)α-LA基因的引物,根據(jù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因奶牛時(shí)構(gòu)建的載體設(shè)計(jì)NPTⅡ和EGFP基因的引物。上述引物(表1)均由Beacon Designer 7.0設(shè)計(jì),由北京Invitrogen公司合成。

1.4 單一PCR檢測(cè)

PCR反應(yīng)體系為25μ L,其中ddH2O 17.25 μ L,10×PCR buffer(含25 mmol/L MgCl2)2.5 μ L,dNTP(2.5 mmol/L)2 μ L,上下游引物(均為10 pmol/L)各為1 μ L,rTaq DNA聚合酶(5 U/μ L)0.25 μ L,基因組(100 mg/L)1 μ L。PCR反應(yīng)

表1 多重PCR引物序列T able 1 primer sequences of multiplex PCR

條件:預(yù)變性94℃5 min;94℃30 s,58℃30 s,72℃30 s,共30循環(huán);延伸反應(yīng)72℃7 min。PCR產(chǎn)物用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定后,回收目的片段。將已純化的目的基因片段連接到pGEM-T載體,轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α中,挑取單克隆經(jīng)PCR鑒定后,送北京諾賽基因有限公司測(cè)序。

1.5 多重PCR檢測(cè)

多重PCR反應(yīng)體系為25 μ L,其中ddH2O 17.50 μ L,10×PCR buffer(含25 mmol/L MgCl2)2.5 μ L,dNTP(2.5 mmol/L)2 μ L,NPTⅡ、α-LA、EGFP基因上下游引物(均為10 pmol/L)各0.25 μ L;B2M基因上下游引物(均為10 pmol/L)各0.125 μ L,rTaq DNA聚合酶(5 U/μ L)0.25 μ L,基因組1(100 mg/L)μ L。PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性94℃5 min,94℃30 s,60℃30 s,72℃30 s,共40循環(huán),延伸反應(yīng)72℃7 min。PCR產(chǎn)物用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果

2.1 單一PCR擴(kuò)增結(jié)果

檢測(cè)外源基因α-LA,NPTⅡ和EGFP 2時(shí)只有轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性奶牛有條帶擴(kuò)增,野生型奶牛和空白對(duì)照均無(wú)條帶擴(kuò)增,檢測(cè)內(nèi)源基因B2M時(shí),轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性奶牛和野生型奶牛均有條帶,空白對(duì)照無(wú)條帶,與預(yù)期結(jié)果一致(圖1)。為了保證擴(kuò)增結(jié)果的準(zhǔn)確性,4個(gè)基因序列都克隆測(cè)序,NPTⅡ和EGFP測(cè)序結(jié)果與生產(chǎn)此轉(zhuǎn)基因奶牛的質(zhì)粒載體序列比對(duì),100%同源;B2M與GenBank中奶牛B2M基因序列100%同源;α-LA測(cè)序結(jié)果與GenBank中人α-LA基因序列99.8%同源。

圖1 各引物PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR products amplified with each primer pairs

2.2 不同退火溫度的多重PCR結(jié)果

因?yàn)閱我籔CR擴(kuò)增時(shí)各引物的退火溫度均較寬(數(shù)據(jù)未發(fā)表),選擇55℃～60℃范圍內(nèi)進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增。隨著溫度的升高4條帶逐漸都得到較好的擴(kuò)增,以60.5℃擴(kuò)增效果最好(圖2)。

圖2 溫度梯度多重PCR擴(kuò)增Fig.2 Multiplex PCR products amplified from gradient annealing temperature

2.3 轉(zhuǎn)基因奶牛多重PCR擴(kuò)增結(jié)果

轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性奶?；蚪M的多重PCR擴(kuò)增條帶大小與預(yù)期一致,3種基因奶牛基因組均能擴(kuò)增4條特異性條帶,而野生型奶牛只能擴(kuò)增內(nèi)源基因B2M,空白對(duì)照沒(méi)有任何條帶(圖3)。

圖3 多重PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Multiplex PCR amplification

3 討論

多重PCR一個(gè)反應(yīng)即可檢測(cè)一個(gè)轉(zhuǎn)基因樣品中的多種外源基因結(jié)構(gòu),盡可能排除假陽(yáng)性或假陰性,使檢測(cè)結(jié)果更可靠。也正因?yàn)槎嘈蛄型瑫r(shí)擴(kuò)增,使反應(yīng)的敏感性受到很多因素的影響,如不同引物對(duì)之間的相對(duì)濃度、退火溫度、緩沖液濃度、Mg2+濃度等[9]。本研究對(duì)引物對(duì)相對(duì)濃度、退火溫度進(jìn)行了優(yōu)化,添加相同的引物濃度時(shí),內(nèi)源基因B2M擴(kuò)增效果最好,其它引物對(duì)擴(kuò)增較弱,而當(dāng)減少B2M引物對(duì)至原來(lái)一半時(shí),各個(gè)引物對(duì)均得到較好擴(kuò)增;從圖2可以看出隨著溫度的升高,多重PCR擴(kuò)增效果越來(lái)越好。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)中,如果延長(zhǎng)延伸時(shí)間,就可能產(chǎn)生過(guò)度延伸的產(chǎn)物,從而影響結(jié)果的判斷。為了避免產(chǎn)生這種非特異性條帶,PCR延伸時(shí)間應(yīng)適當(dāng)縮短[10],因考慮到本研究選取的的4對(duì)引物相隔較遠(yuǎn)(至少2 000 bp),延伸時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)亦不會(huì)產(chǎn)生過(guò)度延伸的產(chǎn)物,本研究中延伸時(shí)間選擇為1 min或30 s時(shí),均能很好的擴(kuò)增三個(gè)條帶,但考慮到節(jié)省時(shí)間,所以延伸時(shí)間選擇30 s。

轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)時(shí),通過(guò)對(duì)內(nèi)源基因進(jìn)行PCR檢測(cè),可以判斷樣品核酸的質(zhì)量,即如果內(nèi)源基因擴(kuò)增失敗,說(shuō)明所抽提的核酸中不含該動(dòng)物的DNA或者所抽提的核酸含有PCR抑制物質(zhì),從而可以避免轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的假陰性結(jié)果,而內(nèi)源基因是單拷貝基因時(shí),能更好的避免假陰性結(jié)果。本試驗(yàn)選擇的內(nèi)源基因B2M是單拷貝基因,不但可以作為多重PCR的內(nèi)源基因,還可以為外源基因定量檢測(cè)及拷貝數(shù)的確定提供借鑒。考慮到檢測(cè)過(guò)程中基因組DNA片段會(huì)有不同程度的降解,內(nèi)源基因的擴(kuò)增片段應(yīng)選擇較短的目的序列,本研究中內(nèi)源基因B2M擴(kuò)增長(zhǎng)度為121 bp,可有效保證轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及衍生產(chǎn)品的檢測(cè)效果。

EGFP和NPTⅡ是制作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)常用的標(biāo)記基因,動(dòng)物自身不攜帶這兩種基因,利用這兩種基因建立的檢測(cè)方法可以對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行初步篩查。對(duì)待檢樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí),如果能同時(shí)擴(kuò)增出兩條特異性條帶,或兩條特異性條帶中任意一條,可以說(shuō)明待檢樣品是轉(zhuǎn)基因樣品。但是很多轉(zhuǎn)基因動(dòng)物不含有這兩個(gè)原件,因此單靠?jī)蓚€(gè)標(biāo)記基因?qū)D(zhuǎn)基因動(dòng)物及其產(chǎn)品進(jìn)行篩查很容易出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。而且轉(zhuǎn)基因動(dòng)物沒(méi)有統(tǒng)一啟動(dòng)子和終止子,不同的表達(dá)蛋白往往需要不同的啟動(dòng)子和終止子。這些因素為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及產(chǎn)品篩查檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)的建立提供了難題。

由于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性評(píng)價(jià)具有累積性和潛在性特點(diǎn),并與社會(huì)、文化及倫理等多方面因素互為影響,所以需要多方位長(zhǎng)期系統(tǒng)的監(jiān)測(cè)才能對(duì)其安全性作出較為客觀的評(píng)價(jià),建立轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)尤為重要。本研究建立的多重PCR方法可用于轉(zhuǎn)基因奶牛的檢測(cè),為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及產(chǎn)品的出入境檢驗(yàn)及檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考。

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