白 帆,陳健舜,程昌勇,陳巧妙,方維煥

(浙江大學(xué)動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)研究所,浙江省動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江杭州310029)

單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,以下簡(jiǎn)稱單核細(xì)胞增生李斯特菌)是一種重要的食源性人獸共患病原菌。主要通過(guò)污染食品而感染宿主,輕則引起胃腸炎,重則引起敗血癥、腦膜炎、流產(chǎn)等,死亡率高達(dá)25%～30%[1]。單核細(xì)胞增生李斯特菌黏附與侵入宿主細(xì)胞的過(guò)程與內(nèi)化素A、B(inlAB)有關(guān),而其細(xì)胞內(nèi)增殖及細(xì)胞間擴(kuò)散能力則由毒力基因plcA、hly、mpl、actA、plcB介導(dǎo)。PrfA(prfA)調(diào)控上述所有毒力因子,與plcA、hly、mpl、actA、plcB構(gòu)成第一毒力島(LIPI-1);inlAB同時(shí)受σB(sigB)的調(diào)控[2]。

并非所有的單核細(xì)胞增生李斯特菌均具有相同的毒力。血清型1/2a在食品中分離率最高,但絕大多數(shù)人李斯特菌病均由4b型引起,1/2a與1/2b型次之。4a與4c型則很少引起人發(fā)病[3]。單核細(xì)胞增生李斯特菌H4是本實(shí)驗(yàn)室從牛奶中分離的弱毒株[4]。本文在對(duì)H4進(jìn)行血清分型與毒力測(cè)定的同時(shí),采用熒光定量PCR的方法比較分析H4與10403S、681主要毒力基因(prfA、plcA、hly、mpl、actA、plcB、inlA、inlB和sigB)的表達(dá)水平差異,為探明其弱毒機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株及培養(yǎng)基

單核細(xì)胞增生李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)菌株10403S系國(guó)際生命科學(xué)協(xié)會(huì)(Internation Life Sciences Institute)北美食品微生物專家委員會(huì)指定的康奈爾李斯特菌菌種保藏室提供,單核細(xì)胞增生李斯特菌分離株H4、681由本實(shí)驗(yàn)室分別分離自消毒奶與原料奶。李斯特菌培養(yǎng)基BHI購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 試劑、引物與儀器

Taq酶、10×PCR buffer購(gòu)自Takara公司;4×dNTPs購(gòu)自上海申能博彩;Trizol總RNA抽提試劑盒購(gòu)自上海生工;反轉(zhuǎn)錄酶、THUNDERBIRD?SYBR Green qPCR Master Mix購(gòu)自Toyobo公司;RNase Free DnaseⅠ、10×buffer with MaCl2for DnaseⅠ為Fermantas公司產(chǎn)品;熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司);其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。所有引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成(表1)。

1.3 血清型鑒定

參照Doumith建立的多重PCR血清分型方法[4],設(shè)計(jì)針對(duì)ORF2819、ORF2110、lmo0737和lmo1118的引物鑒定單核細(xì)胞增生李斯特菌10403S、H4、681的血清型(表1)。其中引物ORF2819特異性識(shí)別血清型為1/2b、3b、4b、4d、4e和4ab的單核細(xì)胞增生李斯特菌,引物ORF2110進(jìn)一步區(qū)分4b、4d、4e和4ab;引物lmo0737識(shí)別血清型為1/2a、3a、1/2c和3c的菌株,而lmo1118進(jìn)一步區(qū)分1/2c和3c。由于3a、3b、3c、4d、4e與4ab在環(huán)境株或臨床株中均非常少見(jiàn),故此PCR體系主要區(qū)分4種常見(jiàn)的致病血清型。同時(shí),lmo1134引物亦被加入PCR體系[5],該基因存在于除譜系III外所有的菌株(表1)。

表1 引物序列T able 1 Primers used in this study

1.4 小鼠LD50試驗(yàn)

ICR小鼠(雌性,20～22克)購(gòu)自浙江省中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。取細(xì)菌過(guò)夜培養(yǎng)物5 000 r/min,4℃離心6 min以收集菌體。用0.01 M PBS(pH 7.4)重懸,細(xì)菌數(shù)至108cfu/mL,并進(jìn)行一系列的10倍梯度稀釋,平板計(jì)數(shù)以確定實(shí)際接種量。同時(shí),選取不同的稀釋度腹腔接種于ICR小鼠,劑量為0.1 mL,每組接種5只小鼠,連續(xù)觀察10 d,用寇氏法計(jì)算LD50。選取10403S為攻毒陽(yáng)性對(duì)照組,PBS為陰性對(duì)照組。

1.5 細(xì)菌總RNA的獲得及反轉(zhuǎn)錄

選用T rizol總RNA抽提試劑盒抽提細(xì)菌總RNA,并加入RNase Free DNaseⅠ除去樣品中基因組DNA污染。反轉(zhuǎn)錄步驟:10 μ L總RNA與1 μ L的下游引物(50 μ M)在65℃水浴中變性10 min,冰浴冷卻10 min后加入4 μ L反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液、2 μ L dNTP mix、2 μ L DTT、0.5 μ L RNase抑制劑與0.5 μ L反轉(zhuǎn)錄酶,反應(yīng)體系總體積為20 μ L,離心混勻后42℃水浴1 h,95℃滅活反轉(zhuǎn)錄酶5 min。cDNA置—20℃貯存。

1.6 熒光定量PCR反應(yīng)體系、條件及結(jié)果分析

反應(yīng)總體積中包括:cDNA 2 μ L,TH UNDERBIRD?SYBR Green qPCR Master Mix 10 μ L,上下游引物(10 μ M)各0.5 μ L,無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)足體積至20 μ L。選用看家基因gyrB作為內(nèi)參。內(nèi)參與目的基因各設(shè)3個(gè)平行反應(yīng)管。反應(yīng)條件:95℃1 min預(yù)變性;95℃5 s,60℃10 s,72℃15 s,共40個(gè)循環(huán);72℃實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào);65℃到95℃每隔6 s檢測(cè)融解曲線,共61個(gè)循環(huán)。

熒光定量PCR結(jié)果分析:—Δ Ct為內(nèi)參基因Ct值減去目的基因Ct值,使用2—ΔCt代表某菌株初始cDNA的相對(duì)量,將H4的基因表達(dá)水平設(shè)為1,另兩株細(xì)菌2—ΔCt與其的比值即能直觀地表示10403S、681與H4主要毒力基因的表達(dá)差異。

2 結(jié)果

2.1 血清分型與小鼠毒力試驗(yàn)

根據(jù)多重PCR結(jié)果,10403S、681與H4的血清型分別為1/2a、4b和4a(表2)。10403S與681對(duì)小鼠的LD50分別為105.5與103.9,為強(qiáng)毒株。而H4對(duì)小鼠的LD50達(dá)108.2,為弱毒株(表2)。

表2 各菌株血清型鑒定結(jié)果及對(duì)小鼠LD50比較Table 2 Serotype of L.monocytogenes isolates and comparison of their virulence in terms of LD50

2.2 LIPI-1基因表達(dá)水平

熒光定量PCR結(jié)果表明,H4的LIPI-1各基因(prfA、plcA、hly、mpl、actA、plcB)表達(dá)水平為10403S與681的102～103倍。由此可見(jiàn),弱毒株H4的LIPI-1表達(dá)水平極顯著高于強(qiáng)毒株,屬于過(guò)量表達(dá)(over expression)(圖1)。

圖1 單核細(xì)胞增生李斯特菌10403S、681與H4株LIPI-1中主要毒力基因表達(dá)水平比較(其中H4的基因表達(dá)水平設(shè)為1)Fig.1 Comparison of ex pression levels of genes within LIPI-1 in L.monocytogenesH4 with those in strains 10403S and 681(expression level of H4 set as 1).

2.3 inlA、inlB與sigB表達(dá)水平

熒光定量PCR結(jié)果表明,H4的sigB表達(dá)水平與10403S與681相近,inlA、inlB表達(dá)水平均高于另兩個(gè)菌株,但差異程度不如LIPI-1明顯(圖2)。

圖2 單核細(xì)胞增生李斯特菌10403S、681與H4 inlA、 inlB和sigB轉(zhuǎn)錄水平比較(H4的基因表達(dá)水平設(shè)為1) Fig.2 Comparison of expression levels of inlA,inlB and sig B in L.monocytogenesH4 with those in strains 10403S and 681 (expression level of H4 set as 1).

3 討論

從1983年至今,北美和歐洲曾報(bào)道多起人類李斯特菌病的暴發(fā),由于其高致死率,李斯特菌病被視為一種重要的食源性疾病。單核細(xì)胞增生李斯特菌首先在InlA(inlA)和InlB(inlB)的介導(dǎo)下,黏附至宿主細(xì)胞膜,之后在具有膜穿孔特性的溶血素LLO(hly)和磷脂酶PI-PLC(plcA)的協(xié)同作用下逃離吞噬體,進(jìn)入宿主細(xì)胞質(zhì)。菌體進(jìn)入胞質(zhì)后的運(yùn)動(dòng)由ActA介導(dǎo),其能聚合肌動(dòng)蛋白并使菌體在胞質(zhì)內(nèi)運(yùn)動(dòng)。而單核細(xì)胞增生李斯特菌在細(xì)胞間的傳遞則由LLO和另一種磷脂酶PC-PLC(plcB)介導(dǎo)[5]。其中PC-PLC需要金屬酶蛋白Mpl(mpl)的剪切從而具有活性[6]。這些毒力因子均受轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子PrfA(prfA)調(diào)控[7]。同時(shí),InlA、InlB的轉(zhuǎn)錄還受σB(sigB)調(diào)節(jié)[8]。

單核細(xì)胞增生李斯特菌分離株H4血清型為4a,對(duì)小鼠毒力較弱。RT-PCR結(jié)果顯示,弱毒株H4中,與細(xì)菌的細(xì)胞內(nèi)感染周期相關(guān)的毒力基因表達(dá)水平均高于另兩株細(xì)菌,其中hly的2—ΔCt值是標(biāo)準(zhǔn)菌株10403S的1180倍。H4的inlA、inlB的表達(dá)水平也較高,但不如LIPI-1中各基因轉(zhuǎn)錄活性高,這可能因?yàn)閕nlA、inlB同時(shí)受σB調(diào)節(jié),而σB在三株細(xì)菌中的轉(zhuǎn)錄水平相近,2—ΔΔCt直觀地顯示了這一趨勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了體外磷脂酶(PC-PLC)活性測(cè)定,發(fā)現(xiàn)H4具有體外強(qiáng)溶脂活性,而10403S與681則無(wú)此現(xiàn)象,表明H4的plcB過(guò)量表達(dá)。本研究亦顯示H4的plcB表達(dá)水平分別比10403S與681高269和157倍,與H4的強(qiáng)溶脂活性表型吻合。因此,H4的弱毒可能與LLO、PC-PLC等膜裂解因子的高表達(dá)有關(guān),H4更易暴露于宿主免疫系統(tǒng)而被清除,從而導(dǎo)致該菌株對(duì)宿主的毒力下降。本研究為探明這類菌株的弱毒機(jī)制奠定了重要的基礎(chǔ)。

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