郭 恒,劉 娟,李慧萍,王學(xué)林,孫樹民,張茂林,高麗芳,徐德啟,2,劉明遠(yuǎn)*

(1.人獸共患病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,吉林大學(xué)人獸共患病研究所,吉林長(zhǎng)春130062;2.美國(guó)食品與藥品管理局(FDA),美國(guó)馬里蘭20892)

狂犬病及其導(dǎo)致的死亡是目前我國(guó)最為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。動(dòng)物狂犬病,尤其是犬狂犬病的流行,是我國(guó)人狂犬病發(fā)生的根本原因[1]。接種疫苗是控制動(dòng)物狂犬病發(fā)生和流行的最有效手段。目前,國(guó)產(chǎn)獸用狂犬病疫苗仍以傳統(tǒng)弱毒活疫苗為主,而滅活疫苗又尚未實(shí)現(xiàn)國(guó)產(chǎn)化,使用成本較高。因此,開(kāi)發(fā)符合我國(guó)國(guó)情和狂犬病流行特點(diǎn)的廉價(jià)、使用方便、安全性高的新型狂犬病口服疫苗將對(duì)從源頭上控制狂犬病在我國(guó)的流行產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。

冰核蛋白(ice-nucleation protein,INP))是丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)的外膜蛋白,可加速純水的冰晶形成。INP通過(guò)糖基磷脂酰肌醇(glucosylphosphatidylinositol,GPI)而錨定在細(xì)菌表面,利于大分子蛋白的表面呈現(xiàn)[2]。GPI錨定系統(tǒng)很少發(fā)現(xiàn)于原核生物中,廣泛用于真核表面蛋白如酵母a-凝集素和哺乳動(dòng)物表面蛋白的錨定。目前使用INP已在大腸埃希菌[2]、沙門菌[3]、鰻弧菌[4]、惡臭假單胞菌[5]、藍(lán)細(xì)菌[6]等革蘭陰性菌表面成功展示多種蛋白。本試驗(yàn)擬在大腸埃希菌工程菌中初步驗(yàn)證我們構(gòu)建的冰核蛋白展示系統(tǒng),為進(jìn)一步研制基于沙門菌的多抗原表位展示性重組疫苗、新型狂犬病疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、毒株和質(zhì)粒 人用狂犬病毒CTN疫苗株由張茂林博士惠贈(zèng),大腸埃希菌(E.coli)JM109、BL21(DE3)、熒光假單胞菌、Vero細(xì)胞、pET28a(+)載體由實(shí)驗(yàn)室保存,pMD-18T載體購(gòu)自TaKaRa公司。

1.1.2 主要試劑 NcoRⅠ、BamHⅠ、XhoⅠ、T4DNA連接酶、DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自MBI公司,AMV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑購(gòu)于Promega公司;Taq DNA聚合酶、DNA標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)、中分子質(zhì)量蛋白標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司,Trizol購(gòu)自Invitrogen公司,鼠源狂犬病毒單抗Rab-50、辣根標(biāo)記羊抗鼠二抗購(gòu)自Santa cruz公司,基因組及質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自V-gene公司。

1.2 方法

1.2.1 冰核蛋白N末端序列的PCR擴(kuò)增 以熒光假單胞菌基因組DNA為模板,設(shè)計(jì)并合成引物如下:INP1:5′-CGC CAT GGA TCT CGA CAA GGC GT T GGT-3′,INP2:5′-CG GGA TCC AAT CAG ATC ACT GTG GT T GCC-3′(下劃線部分為酶切位點(diǎn),下同)。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定后純化回收(具體操作步驟參照DNA凝膠回收試劑盒說(shuō)明書),連接于pMDl8一T載體構(gòu)建重組質(zhì)粒。PCR和NcoⅠ、BamHⅠ雙酶切質(zhì)粒(質(zhì)粒提取步驟參照質(zhì)粒小提試劑盒說(shuō)明書)鑒定正確后送北京華大基因研究中心進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名為18T-INP。

1.2.2 狂犬病毒CTN株G蛋白序列的PCR擴(kuò)增根據(jù)GenBank中收錄的CTN株序列設(shè)計(jì)引物如下:CTN-G1:5′-CGG GAT CCA A AT TCC CCA TT T ACA CGA TAC C-3′,CTN-G2:5′-CCC TCG AGT TAC AG C TTG GTC TCA CCT -3′。使用Trizol從感染狂犬病毒CTN-30株的Vero細(xì)胞培養(yǎng)液中直接提取總RNA,使用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶在42℃60 min下逆轉(zhuǎn)錄合成G基因的cDNA,進(jìn)而擴(kuò)增G基因,并按1.2.1方法構(gòu)建重組質(zhì)粒18TRVG。

1.2.3 重組表達(dá)載體的構(gòu)建 將質(zhì)粒18T-INP用NcoⅠ和BamHⅠ雙酶切,回收目的片段。該片段與相同酶切的pET28a(+)載體片段16℃在T4 DNA連接酶作用下連接2 h,轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌BL21(DE3)中。按1.2.1方法進(jìn)行陽(yáng)性菌篩選、鑒定等,重組質(zhì)粒命名為pET28a-INP。BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切質(zhì)粒18T-RVG,同法將回收的目的片段插入pET28a(+)和pET28a-INP載體相應(yīng)位點(diǎn),構(gòu)建重組表達(dá)載體pET28a-RVG和pET28a-INPRVG并轉(zhuǎn)入BL21(DE3)菌中。

1.2.4 重組載體的表達(dá) 將鑒定正確的重組菌分別按1∶100接種于新鮮的含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中,振蕩培養(yǎng)至吸光度(OD600)為0.4～0.6時(shí),加入IPTG使其終濃度為1 mmol/L,16℃誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h,以空載體pET28a轉(zhuǎn)化BL21(DE3)菌為陰性對(duì)照。分別收集1 mL菌液離心棄上清,重懸于4×SDS-PAGE上樣緩沖液中,煮沸變性5 min,6 000 r/min離心5 min后120 g/L SDS-PAGE電泳檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。

1.2.7 整體細(xì)胞ELISA 將細(xì)菌懸浮于PBS中并稀釋至OD600=1.0,包被微量滴定板100 μ L樣品4℃過(guò)夜。過(guò)多的細(xì)胞被去除,200μ L含50g/L BSA的PBS 37℃包被1 h,去除封閉液后,洗3遍,1∶1 000鼠抗RV單克隆抗體Rab-50孵育1 h(37℃)。PBS洗3遍后,1∶10 000辣根標(biāo)記的羊抗鼠二抗孵育1 h(37℃)。含0.05%Tween-20的PBST洗3遍,TMB solution顯色。2 mol/L H2 SO4終止反應(yīng),450 nm測(cè)光吸收度(Bio-Rad,Hercules,CA)。

2 結(jié)果

2.1 基因的克隆

以提取的丁香假單胞菌基因組為模板,擴(kuò)增出N端截?cái)嗟腎NP cDNA片段。以提取的狂犬病毒CTN株總RNA為模板,RT-PCR擴(kuò)增出不含信號(hào)肽序列的G基因的cDNA片段。10 g/L瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示分別約為600 bp和1 500 bp左右(圖1),與理論值(609 bp和1 518 bp)相符。INP序列測(cè)定結(jié)果表明,本研究所克隆的INP基因與華東理工大學(xué)張?jiān)d教授克隆的丁香假單胞菌MB03株的冰核蛋白(inaQ)核酸同源性最高,一致性為96%,有5處核苷酸存在差異,并導(dǎo)致兩處氨基酸發(fā)生變化。我們比較了這兩種冰核蛋白展示外源蛋白的效果未見(jiàn)有明顯差異(未發(fā)表)。CTN-G序列測(cè)定表明其與GenBank中注冊(cè)的序列一致,沒(méi)有發(fā)生突變。

圖1 INP和CTN-G基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The amplified results of INP and Rabies virus glycoprotein by PCR

2.2 重組載體的構(gòu)建

將PCR產(chǎn)物與pMD-18T載體連接,PCR和雙酶切鑒定正確后將相應(yīng)的片段插入原核表達(dá)載體pET28a(+)中,構(gòu)建重組表達(dá)載體pET28a-INPRVG。該載體質(zhì)粒分別以NcoⅠ/BamHⅠ、BamHⅠ/XhoⅠ、NcoⅠ/XhoⅠ進(jìn)行酶切鑒定,可得到對(duì)應(yīng)的約600、1500、2 010 bp的特異切割帶(圖2),與理論值相符。

圖2 pET28a-INP-RVG質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.2 Identification of the recombinant plasmid by double enzyme digestion

2.3 重組載體的表達(dá)

pET28a-INP、pET28a-RVG、pET28a-INPRVG重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸埃希菌BL21(DE3)宿主菌中,16℃誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h后菌體裂解物經(jīng)SDSPAGE,分別在24、56 ku、77 ku處出現(xiàn)明顯的蛋白表達(dá)帶,而pET28a-INP-RVG重組菌還可在56 ku觀測(cè)到較弱的蛋白帶,而未誘導(dǎo)及非重組pET28a對(duì)照菌均無(wú)特異性蛋白帶,與理論相對(duì)分子質(zhì)量(24.1、56.6、77.8 ku)相符(圖3)。

圖3 重組質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測(cè)Fig.3 SDS-PAGE analysis of the recombinant protein

2.4 蛋白表面展示的初步鑒定

整體細(xì)胞ELISA用于對(duì)細(xì)胞表面展示蛋白情況進(jìn)行鑒定。含pET28a-INP、pET28a–RVG、pET28a-INP-RV質(zhì)粒的大腸埃希菌誘導(dǎo)表達(dá)后直接包被微量滴定板,測(cè)得的OD450值分別為0.023 8、038 8和0.165 4(圖4)。相對(duì)來(lái)說(shuō),含pET28a-INPRVG質(zhì)粒的重組菌有更高的吸光度值(分別約是前者的4倍和7倍)。由于使用的是未經(jīng)破碎的誘導(dǎo)后的完整大腸埃希菌進(jìn)行包被,只有表面展示病毒保護(hù)性抗原的重組菌才可被狂犬病毒糖蛋白單抗Rab-50識(shí)別,說(shuō)明我們構(gòu)建的重組蛋白成功展示在細(xì)胞表面。

圖4 整體細(xì)胞ELISA結(jié)果Fig.4 Whole-cell ELISA of recombinant cells

3 討論

在活細(xì)菌表面展示外源蛋白在微生物學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)和生物工藝學(xué)方面有重要的應(yīng)用價(jià)值。在細(xì)菌表面展示外源抗原利于免疫系統(tǒng)識(shí)別抗原,在其它細(xì)菌表面成分作用下起到間接免疫佐劑的作用。大多數(shù)展示系統(tǒng)展示的外源抗原大小受限制,同時(shí)展示多亞基抗原較難成功。而INP細(xì)胞表面展示系統(tǒng)因其展示外源蛋白大、穩(wěn)定、安全、檢測(cè)方便等特性近年來(lái)引起了更多的關(guān)注。INP含圓柱狀的中央重復(fù)區(qū),其在冰晶的形成過(guò)程中起催化作用,而其對(duì)膜的錨定是非必須的,因此可用作一個(gè)模塊空間來(lái)控制外源蛋白和細(xì)胞表面之間的長(zhǎng)度。當(dāng)INP表達(dá)于細(xì)胞表面時(shí),集聚的INP形成糖脂蛋白(glycolipoprotein)復(fù)合物,抵抗蛋白酶降解,保持在靜止期的安全性。表達(dá)的INP融合蛋白并未導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)的破壞或宿主生長(zhǎng)的障礙,因此INP能在細(xì)胞表面過(guò)量表達(dá)大分子異源蛋白(如90 ku[7])。INP包含3個(gè)結(jié)構(gòu)域,即N端獨(dú)特區(qū)(CRD),中央重復(fù)區(qū),C端特殊區(qū)。N端由175或179個(gè)氨基酸組成,可通過(guò)膜-插入信號(hào)肽序列錨定到外膜上;圓柱狀的中央?yún)^(qū)由重復(fù)的8-,16-,48-殘基組成,其在冰晶的形成過(guò)程中起催化作用;C端由49個(gè)aa組成,親水并定位于細(xì)胞外。目前,基于INP的細(xì)菌表面展示系統(tǒng)有多種構(gòu)建方法,主要取決于外源蛋白融合的部位。雖然融合到C端、N端(保留不同數(shù)目的重復(fù)單元)或二者之間均取得了很好的效果,為盡量降低載體的體積,我們將G蛋白插入到截?cái)嗟腘端區(qū),同時(shí)為避免展示的蛋白間的潛在的立體空間障礙,又保留了兩個(gè)重復(fù)亞基(32 aa),初步實(shí)驗(yàn)顯示基于冰核蛋白的細(xì)菌表面展示系統(tǒng)構(gòu)建成功。

孟勝利等[8]研究發(fā)現(xiàn)人用狂犬病毒CTN疫苗株與我國(guó)分離的街毒株糖蛋白的核酸和氨基酸同源性最高。本實(shí)驗(yàn)提取CTN-30病毒總RNA,RTPCR方法成功克隆到G基因片段,序列分析表明與CTN-1株序列一致,未出現(xiàn)突變?？袢《镜奶堑鞍譍是病毒與宿主細(xì)胞結(jié)合的配體,介導(dǎo)了病毒與靶細(xì)胞的結(jié)合及在神經(jīng)系統(tǒng)的分布。其不但與病毒的毒力、致病性密切相關(guān),而且是狂犬病毒的主要保護(hù)性抗原,能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體,保護(hù)機(jī)體抵抗病毒的感染。狂犬病毒的糖蛋白G含有糖基化位點(diǎn),直接使用原核表達(dá)系統(tǒng)用于疫苗的構(gòu)建是不適合的,但展示表位將不存在該問(wèn)題的困擾。目前G基因的中和線性表位已被插入到犬腺病毒2型載體中[9],顯示了很好的應(yīng)用前景。由于T7表達(dá)系統(tǒng)是非常成熟的原核表達(dá)系統(tǒng),我們?cè)诖竽c埃希菌工程菌中對(duì)構(gòu)建的表面展示系統(tǒng)進(jìn)行驗(yàn)證后,將構(gòu)建一種表面展示狂犬病毒中和線性表位的減毒鼠傷寒沙門菌,并最終將其用于新型狂犬疫苗的運(yùn)載體。

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