步衛(wèi)東

(北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,北京100097)

病毒能在活細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和增殖,因此,病毒培養(yǎng)物中都含有大量的宿主細(xì)胞碎片及其亞細(xì)胞組分,病毒本身含量偏低。提純應(yīng)在不使病毒損傷和失活的前提下,減少非病毒雜質(zhì),提出高純度的濃縮病毒;濃縮、提純可根據(jù)病毒本身特性采取不同的方法。本文利用流感病毒在4℃對紅細(xì)胞有凝集作用,即流感病毒在0℃～4℃被紅細(xì)胞表面受體(含唾液酸的糖蛋白)吸附,但在37℃又從紅細(xì)胞上(神經(jīng)氨酸酶受體被破壞)游離下來特性,用紅細(xì)胞對其進(jìn)行濃縮、純化[1]。

1 材料和方法

1.1 50%紅細(xì)胞懸液的制備

健康SPF180 d公雞3只,翅靜脈采血加入兩倍量阿氏液抗凝,按紅細(xì)胞洗滌方法洗滌3次(前2次2 000 r/min離心5 min,第3次離心10 min),棄上清,加9 g/L的生理鹽水制成50%的紅細(xì)胞懸液,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 H9N2亞型禽流感病毒的增殖

H9N2病毒液增殖:經(jīng)國家流感中心鑒定為H9N2亞型的雞源毒株A/Chick/hebei/98(H9N2),為F2代,常量法HA為29,毒價為107.625EID50/0.1 mL。將種毒進(jìn)行10—6稀釋,10日齡SPF雞胚,尿囊腔接種0.1 mL/枚,37℃孵化,棄24 h死亡胚,48 h～96 h收獲尿囊液,HA測定為29,放于—20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑和儀器

9 g/L的生理鹽水,1%紅細(xì)胞懸液,96孔血凝板,恒溫水浴鍋,8道移液器,4℃冰箱,溫箱,生物安全Ⅱ級實驗室(京)動防(合)字D05064號。

1.4 病毒粗提

凍融3次的H9N2尿囊液經(jīng)3 500 r/min離心15 min,吸上清,沉淀的雜蛋白棄掉,收集備用。

1.5 紅細(xì)胞吸附-釋放試驗

取經(jīng)粗提的H9N2病毒尿囊液50 mL,加入已制備的50%的紅細(xì)胞30 mL,充分振蕩混合均勻,放4℃吸附[2],期間分別在1、2.5、4、8 h吸取上清,測定HA效價,并且在1 h、4 h輕輕振蕩一次,8 h充分振蕩,放4℃過夜,經(jīng)過16 h～18 h,上清液HA≤24,停止吸附,1 500 r/min離心15 min去上清,沉淀按1∶10(比例按病毒原液體積的1/10計算)加入9 g/L生理鹽水5 mL,37℃水浴4 h,期間每隔30 min振蕩一次(這期間有可能出現(xiàn)溶血),在1、2、3、4 h吸取上清液100 μ L,測定HA,4 h取出,1500 r/min離心20 min,取上清液,測定HA。

1.6 紅細(xì)胞凝集特性試驗

洗脫下來的紅細(xì)胞加入9 g/L生理鹽水洗滌2次,制成1%的紅細(xì)胞,按參考文獻(xiàn)[2]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行H9N2禽流感病毒HA測定。

2 結(jié)果

2.1 H9N2禽流感病毒濃縮、提純和HA測定結(jié)果

H9N2禽流感病毒經(jīng)紅細(xì)胞濃縮、部分提純后,HA效價提高了3個滴度,但37℃水浴振蕩過程中造成了微量溶血。按考文獻(xiàn)[2]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行HA測定,在25℃～28℃室溫加入1%雞紅細(xì)胞懸液,加入10 min后觀察結(jié)果,可以進(jìn)行判定,但前4孔平鋪孔底的紅細(xì)胞很快卷曲,下滑。結(jié)果見表1。

2.2 提純H9N2禽流感病毒與洗脫下紅細(xì)胞凝集特性試驗

經(jīng)紅細(xì)胞濃縮、提純后的H9N2禽流感病毒,還能凝集新的雞紅細(xì)胞;但洗脫下的紅細(xì)胞不能凝集H9N2禽流感病毒。

表1 不同時間H9N2禽流感病毒HA測定結(jié)果T able 1 H9N2 virus HA titers in different time

3 討論

本方法利用禽流感病毒4℃對紅細(xì)胞凝集、37℃釋放的生物特性,進(jìn)行病毒濃縮、提純,使病毒濃度提高。但濃縮后病毒進(jìn)行HA測定時,試驗前4孔解凝速度加快,分析原因是因為病毒在反復(fù)試驗中增加了溫度反應(yīng)的敏感性,致使神經(jīng)氨酸酶(受體破壞酶)解凝作用近一步加強(qiáng)。同時洗脫下來的紅細(xì)胞包膜表面神經(jīng)氨酸酶受體被破壞,因此失去了凝集流感病毒的能力。

禽流感H9N2病毒經(jīng)紅細(xì)胞提純后,病毒血凝價提高3個滴度,結(jié)果與曹康等[3]的試驗結(jié)果基本一致。同時用3只健康SPF公雞血混合制備提純紅細(xì)胞懸液,可避免紅細(xì)胞非特異凝集反應(yīng)發(fā)生和其他病毒污染。結(jié)果證明該方法是可行的。

此方法只用50 mL雞胚尿囊液就獲得15 mL HA效價提高23倍的純化流感病毒,表明該方法可節(jié)省病毒雞胚尿囊液的用量,純化效率高。同時對設(shè)備要求不高,因此是一種經(jīng)濟(jì)實用的純化流感病毒的方法,值得推廣。

[1] 殷 震,劉景華.動物病毒學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社,1997:308.

[2] 郭元吉,程小雯著.流行性感冒病毒及其實驗技術(shù)[M].北京:中國三峽出版社,1997:143-144.

[3] 曹 康,張衛(wèi)東,施橋發(fā).等.兩種純化流感病毒方法比較研究[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2005,26(3):178-181.