鄭亞紅,張 鵬,楊增岐*,韓青松,張淑霞,黨如意

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,陜西楊陵712100;2.尉氏職業(yè)中等專業(yè)學(xué)校,河南尉氏475500)

新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的禽類的一種高度接觸性、致死性的病毒性傳染病[1]。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為必須報告的動物傳染病[2],在我國被列為一類動物疫病。NDV的宿主范圍非常廣泛,野生鳥類被認為是NDV的重要儲存宿主[1]。目前,除家禽外,至少236種鳥可自然或?qū)嶒炐愿腥綨DV,它們作為病毒攜帶者在NDV的傳播中發(fā)揮作用[3]。近年來,許多特禽、珍禽因感染NDV而發(fā)病、死亡的報道不斷出現(xiàn),如鴿、鶴鶉、鶴鴿、鴕鳥等。2001年范光麗等[4],2003年曲紅利等[5],2006年賈文孝等[6]先后對朱鹮新城疫進行了報道。朱鹮是當(dāng)今世界瀕危的鳥類之一,目前,盡快控制新城疫對朱鹮種群的危害是當(dāng)前朱鹮保護工作的一項緊迫任務(wù)。

NDV是禽副黏病毒科、禽病毒屬的成員,基因組是一個單鏈、負股的RNA,從5′到3′的基因順序為L基因、HN基因、F基因、M基因、P基因、NP基因[7]。F基因編碼的F蛋白不僅能促進病毒囊膜與宿主細胞膜融合,而且能促進相鄰宿主細胞之間發(fā)生融合。不同毒株F基因的序列有差別,這些差別主要集中在F蛋白的裂解位點區(qū)(112～117),強毒株在這一區(qū)域的序列是112R/K-R-Q-R/K-R-F117,而弱毒株的相應(yīng)序列是112G-R/K-Q-G/S-L117[8]。為了解朱鹮NDV的分子生物學(xué)特性及致病性,本研究對一株朱鹮源NDV陜西省分離株的F基因重要功能片段進行了RT-PCR擴增,測定了其氨基酸序列,與GenBank登錄的NDV代表毒株F基因相應(yīng)片段進行了同源性比較,并構(gòu)建了遺傳進化樹,以期為朱鹮新城疫的分子流行病學(xué)調(diào)查和防控提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 朱鹮新城疫病毒陜西分離株由西北農(nóng)林科技大學(xué)禽病研究室2006年分離保存。

1.1.2 主要試劑 NDV陽性血清、AIV陽性血清(H5、H9)等均由西北農(nóng)林科技大學(xué)禽病研究室提供;非免疫雞胚購自楊凌綠方生物工程公司;Trizol試劑盒購自美國Invitrogen公司;RNA酶抑制劑、Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA Marker、pMD18-T克隆載體試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司;DH5α感受態(tài)細胞由西北農(nóng)林科技大學(xué)禽病研究室制備;其他試劑均為國產(chǎn)分析純化學(xué)試劑。

1.2 方法

1.2.1 病毒的增殖 將病毒接種于9日齡～11日齡非免疫雞胚,以尿囊腔接種,每胚0.2 mL,棄24 h內(nèi)死胚,收集24 h～96 h后死亡雞胚的尿囊液,按參考文獻[9]進行血凝試驗(HA)和血凝抑制試驗(HI),其血凝價在25以上的,加雙抗,后在—20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 HA與HI試驗 用NDV和禽流感病毒(AIV)H5、H9標(biāo)準(zhǔn)陽性血清按文獻[9]標(biāo)準(zhǔn)操作。

1.2.3 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank登錄的F48E9標(biāo)準(zhǔn)毒株(AY508514)NDV F基因核苷酸序列,用primer5.0設(shè)計了一對特異性引物,F1:5′-ATGGGCTCCAGA(T/C)CT TCTAC-3′,F2:5-CTGCCACTGCTAGTTGTGATAATCC-3′,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成,預(yù)期擴增片段長度為535 bp。

1.2.4 RNA的提取 根據(jù)T rizol試劑盒說明書操作,提取病毒RNA。

1.2.5 RT-PCR反應(yīng)

1.2.5.1 反轉(zhuǎn)錄 根據(jù)MBI公司Fermentas反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作,合成cDNA。

1.2.5.2 PCR擴增 取上述cDNA 2 μ L,分別加入ExTaq 10×緩沖液2.5 μ L,dNTPS 2.0 μ L(2.5 mmol/μ L),上游引物F1(20 pmol/L)1 μ L,下游引物F2(20 pmol/L)1 μ L,Ex TaqDNA聚合酶0.5 μ L(5 U/μ L),補滅菌超純水至25 μ L,充分混勻并瞬時離心,進行PCR反應(yīng)。PCR程序如下:94℃變性5 min;94℃變性1 min 90 s,55℃1 min,72℃1 min 40 s,30個循環(huán);72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后取PCR產(chǎn)物5 μ L,于15 g/L瓊脂糖凝膠電泳,觀察所擴增片段的大小,并拍照。

1.2.5.3 RT-PCR產(chǎn)物的純化回收 將RT-PCR產(chǎn)物在15 g/L瓊脂糖凝膠中電泳,切下目的條帶,按北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司的DNA快速純化/回收試劑盒說明書回收目的片段,置—20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 目的基因的克隆與鑒定

1.2.6.1 目的基因的克隆 將純化回收的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸埃希菌。在含氨芐青霉素的選擇培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)過夜后,挑取單菌落在含氨芐青霉素選擇培養(yǎng)液中擴大培養(yǎng)10 h。

1.2.6.2 重組菌液PCR和雙酶切 以1.2.6.1所得的菌液為模板,用PCR方法進行陽性克隆鑒定。篩選陽性克隆抽提質(zhì)粒,用EcoRⅠ和HindⅢ進行酶切鑒定。將鑒定為陽性的克隆送北京奧科測序公司進行序列測定。

1.2.7 序列分析 將測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進行在線比對;從GenBank下載具有代表性序列,利用DNA Star軟件對NDV/Crested ibis/ShX/China/2006分離株的F基因片段與GenBank中登錄的多株NDV相應(yīng)基因片段進行核苷酸及氨基酸序列同源性比較,繪制系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

2 結(jié)果

2.1 病毒的增殖與鑒定

所收集尿囊液的HA為陽性,血凝價為28。在HI試驗中,NDV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的HI為陽性,AIV(H5和H9)標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的HI均為陰性,表明病毒增殖成功,將其命名為NDV/Crested ibis/SHX/China/2006(簡稱Crested ibis)。

2.2 F基因的RT-PCR擴增

經(jīng)RT-PCR擴增,獲得1條535 bp的特異性擴增條帶,與預(yù)期擴增的目的片段大小相符(圖1)。

圖1 NDV分離株F基因的RT-PCR擴增結(jié)果Fig.1 The results of amplification of NDV F gene by RT-PCR

2.3 F基因的克隆及鑒定

以菌液為模板,用RT-PCR方法進行陽性克隆鑒定,得到約535 bp的特異性片段,與預(yù)期結(jié)果相符(圖2)。重組質(zhì)粒用EcoRⅠ和HindⅢ進行雙酶切,切出535 bp的特異性片段,與預(yù)期擴增片段大小相符(圖3)。

圖2 重組質(zhì)粒菌液PCR鑒定結(jié)果Fig.2 The results of identifying the positive plasmid by bacterium PCR

圖3 重組質(zhì)粒限制性酶切鑒定結(jié)果 Fig.3 The results of identification of recombinant plasmid by restriction endonuclease digestion

2.4 F基因部分片段核苷酸及推導(dǎo)的氨基酸序列同源性分析

重組質(zhì)粒的測序結(jié)果表明,分離株F基因片段的長度為535 bp,與預(yù)期擴增片段長度相符。應(yīng)用DNA Star軟件推導(dǎo)其氨基酸序列,將SHXLG毒株的F基因的核苷酸序列與GenBank中登錄的新城疫代表毒株進行同源性比較,F基因核苷酸序列同源性在84.0%～98.7%之間(圖4);氨基酸同源性在83.8%～96.6%之間(圖5);其中與JS-5-01-Go(登錄號:AF456442)株核苷酸和氨基酸的同源性較高,分別為98.7%～96.6%。

圖4 朱鹮NDV分離株和參考毒株F基因核苷酸序列的同源性Fig.4 Homology of the nucleotide sequence of F gene of NDV/Crested ibis/ShX/China/2006 and reference strains(%)

圖5 朱鹮NDV分離株和參考毒株F蛋白氨基酸序列的同源性Fig.5 Homology of amino acid sequences of F protein of NDV/Crested ibis/ShX/China/2006 and reference strains(%)

對SHXLG毒株F蛋白裂解位點區(qū)(112～117)的研究,決定NDV毒力強弱與F蛋白裂解位點區(qū)112位～117位氨基酸序列組成有關(guān)[10],強毒株區(qū)的氨基酸序列為Arg-Arg-Gln-Arg/Lys-Arg-Phe;弱毒株區(qū)的氨基酸序列為Gly-Arg/Lys-Gln-Gly/Ser-Arg-Leu;NDV SHXLG株F基因在此區(qū)氨基酸序列為Arg-Arg-Gln-Lys-Arg-Phe(表1);其F蛋白的101位為K(懶氨酸)和121位為V(纈氨酸)兩個特征性氨基酸,這在分子水平上證明了NDV SHXLG為NDV強毒株。

表1 本研究中應(yīng)用的新城疫毒株來源及其F蛋白裂解位點(112～117)的氨基酸組成Table 1 Origin of NDV strains used in this study and the composition of the amino acid sequences of cleavage site(112-117)of F protein

2.5 F基因片段進化樹的構(gòu)建

應(yīng)用NDA Star軟件將NDV/Crested ibis/SHX/China/2006分離毒株的F基因序列與國內(nèi)外已發(fā)表的NDV相應(yīng)片段序列進行同源性比較,利用MegAlign軟件繪制NDV的系統(tǒng)發(fā)育進化樹。結(jié)果顯示,NDV/Crested ibis/SHX/China/2006分離株與JS-5-01(登錄號:AF456442)在同一系統(tǒng)進化上親緣關(guān)系較近,同屬于基因Ⅶ型(圖6)。

圖6 NDV分離株與參考毒株F基因系統(tǒng)進化樹Fig.6 Phylogenetic tree of of F gene of NDV/Crested ibis/ShX/China/2006 and reference strains

3 討論

本研究所用病毒接種雞胚后,雞胚在36 h～60 h死亡,死胚全身廣泛出血,頭部、頸部、肢端最嚴重。筆者通過對NDV陜西朱鹮分離毒株的F基因核苷酸和推導(dǎo)氨基酸的序列分析發(fā)現(xiàn),所分離的毒株存在一定數(shù)量的無義突變,分離毒株F蛋白的裂解位點為112R-R-Q-K-R-F117,符合強毒株的分子特征,表明此次分離到的朱鹮NDV陜西分離株為強毒株。應(yīng)用NDA Star軟件將NDV/Crested ibis/ShX/China/2006分離毒株的F基因序列與國內(nèi)外已發(fā)表的NDV相應(yīng)片段序列進行同源性比較,發(fā)現(xiàn)此毒株與參考毒株的核苷酸、氨基酸同源性分別為84.0%～98.7%、83.8%～96.6%;其中NDV/Crested ibis/ShX/China/2006與JS-5-01(登錄號AF456442)同源性較高,其核苷酸、氨基酸同源性分別為98.6%和96.6%;與疫苗株La Sota株核苷酸和氨基酸的同源性分別為84.3%和84.9%;與國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)強毒F48E8核苷酸和氨基酸同源性為86.2%和87.2%,與其同源性較低。從各方面分析表明,分離到的朱鹮NDV陜西分離株與傳統(tǒng)的疫苗株在基因水平上存在一定的差異。

研究表明,目前在我國部分地區(qū)流行的NDV的主導(dǎo)基因型是基因Ⅶ型。如中國臺灣學(xué)者[11]對1984年至1998年間中國臺灣分離株進行遺傳進化分析,結(jié)果表明這些分離株均歸于基因Ⅶ型。劉華雷等[12]分析了我國部分地區(qū)的8株NDV,結(jié)果7株屬于基因Ⅶ型。曹殿軍等[13]在分析國內(nèi)NDV分離株時發(fā)現(xiàn),30株NDV分離株中有15株(1997年—1999年分離的14株及1991年分離的1株)屬于基因Ⅶ型,其余15株則分別屬于另外7個基因型。吳艷濤等[14]對1997年—2001年從江蘇、浙江兩省發(fā)病鵝群分離的11株NDV毒株進行分析,發(fā)現(xiàn)10株歸入基因Ⅶd型,另一株歸入基因Ⅵ型。本研究中根據(jù)Lomniczim等建立的方法對NDV分離株F基因重要功能區(qū)片段進行了克隆和序列分析,將此毒株與近期國內(nèi)外發(fā)表的一些有代表性的參考毒株所構(gòu)建的基因進化樹表明,此毒株與基因Ⅶ型NDV的代表株Taiwai95株在進化樹同屬一個大分支,該分離株應(yīng)屬于基因Ⅶ型毒株,與近年來在我國家禽中流行的NDV主要基因型相一致,此分離株與JS-5-01-GO(登錄號:AF456442)有較高同源性,說明朱鹮NDV與鵝源NDV、雞源NDV之間存在較為密切的親緣關(guān)系。

為防止NDV對朱鹮的侵襲,建議對朱鹮生活場所周圍禽類加強管理,搞好預(yù)防免疫措施,防止將疫病傳染給朱鹮種群。朱鹮保護觀察站要密切觀察朱鹮種群的表現(xiàn)及發(fā)病情況,定期對朱鹮進行血清學(xué)監(jiān)測,了解朱鹮體內(nèi)新城疫抗體水平的動態(tài)變化,隨時做好免疫預(yù)防的準(zhǔn)備,以防患于未然。

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