葉 芬,蔡家利

(1.西南大學動物科技學院,重慶400715;2.重慶理工大學藥學與生物工程學院,重慶400050)

混合感染已經成為豬群發(fā)病的普遍現(xiàn)象,使病情更為復雜,增加了臨床和實驗室診斷難度,因此,對多種疫病同時做出診斷,及早制定和采取相應防制措施是現(xiàn)代動物疫病檢疫新的發(fā)展方向?；蛐酒诓≡w檢測方面具有獨特的優(yōu)勢,它以高通量并行檢測的方式,可以使病料中的多種病原體同時被檢出,具有快速、高效、靈敏的特點,尤其適宜于大規(guī)模的樣本檢測。它為生物學研究提供了高通量的技術手段,已在病原體基因分型、基因表達譜分析、藥物篩選等各個領域顯示出廣闊的應用前景,對于病毒性病原體的檢測,已有較多報道[1-3]。但多數(shù)研究集中于單病毒的基因分型或少數(shù)病毒的低密度基因芯片檢測[4],在豬的重大病毒性疾病方面的應用也是如此。

1 基因芯片概述

1.1 基因芯片及其原理

基因芯片的概念來源于計算機芯片,又稱為DNA芯片、DNA微陣列。它是由大量已知序列的DNA或者寡核苷酸探針密集排列所形成的探針陣列?；蛐酒幕竟ぷ髟硎墙涍^標記的待測樣本DNA通過與芯片上特定位置的探針雜交,可根據(jù)堿基互補配對的原理確定靶DNA序列[5]。經過分析處理芯片的雜交檢測圖像,可以對細胞和組織中大量的基因信息進行分析?；蛐酒軌驅崿F(xiàn)生物信息的大規(guī)模檢測分析,是一種進行DNA序列分析及基因表達信息分析的強有力工具[6]。基因芯片由支持物、連接層和DNA分子探針陣列3部分組成,該項技術主要包括DNA方陣的構建、樣品的制備和標記、分子雜交和雜交圖譜的檢測分析。

1.2 基因芯片技術的分類

基因芯片技術的分類方法很多,最常用的是按載體上所點探針的類型分為2種[7]:①cDNA芯片,由Schena建立,是將特定的cDNA經PCR擴增后借助機械手直接點到基片上;②寡核苷酸芯片,由Fodo首先報道,用照相平板印刷術和固相合成技術在基片上生成寡核苷酸,分為長寡核苷酸芯片和短寡核苷酸芯片。目前,關于不同基因芯片技術的靈敏度和特異性仍存在爭議。起初,人們認為長寡核苷酸芯片和cDNA芯片有更高的特異性和靈敏度,現(xiàn)在看來,短寡核苷酸芯片同樣有很高的特異性,因為每一個基因代表11個～20個寡核苷酸[8]。

2 基因芯片在豬重大病毒性疾病檢測中的應用

目前,我國豬重大傳染病流行的主要特點是多病原混合感染,繁殖障礙性傳染病普遍存在,呼吸道傳染病日益突出,給我國養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經濟損失[9]。目前對病毒性傳染病的診斷多采用病原分離及常規(guī)的血清學方法進行,但病原分離不僅費時費力,而且敏感性和特異性都較差,血清學診斷方法也因實驗室條件和診斷方法的不同而產生不同的差異。雖然已有PCR診斷方法應用于病毒檢測,但需分別進行診斷。而近年來發(fā)展起來的基因芯片技術具有高通量和并行化的特點,可以對成百上千甚至上萬個基因進行同時、快速、準確的檢測,從而很好地解決了這一問題[10]?；蛐酒夹g在豬重大病毒性疾病中的應用主要有以下幾個方面。

2.1 病毒性疾病檢測的低密度基因芯片

迄今,基因芯片檢測的敏感性仍不是很高。因此,用基因芯片技術檢測病毒性病原體前,須對病原體靶核酸進行擴增。由于同一屬內不同病毒或同一類病毒之間的基因組結構相似,通過序列比對,容易找到同源性高的序列,在該區(qū)域設計PCR引物,可以用盡量少的引物對擴增盡量多的病毒。而且特異PCR擴增能有效避免細胞成分對檢測結果的干擾,提高基因芯片檢測的特異性。因此,在豬的幾種重大病毒性疾病的研究中利用低密度基因芯片進行病毒性病原體檢測的研究較多。

姜永厚等[11]建立的豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)基因芯片檢測方法,結合了PCR的高靈敏度和核酸雜交高特異性優(yōu)點,可根據(jù)需要在芯片上分區(qū)點制多個相同的CSFV陣列以同時特異靈敏地檢測多個CSFV樣本,利用該方法對87個臨床樣品進行了檢測鑒定,結果分析顯示,可準確鑒別CSFV,靈敏度與瓊脂糖凝膠檢測接近,可檢測到的質粒最低濃度為0.4 pg/μ L。曹三杰等[12]采用PCR擴增制備豬傳染性胃腸炎病毒(T ransmissible gastroenteritis virus,TGEV)的靶基因并進行純化,對基因芯片的最佳靶基因點樣質量濃度、探針質量濃度、雜交溫度、雜交時間進行篩選,選擇構建檢測芯片的最適靶基因,進行基因芯片探針最佳標記方法試驗,從而從各個方面優(yōu)化了該疾病的基因芯片診斷方法。高淑霞等[13]分別將豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、豬偽狂犬病病毒(Pseudo rabies virus,PRV)、豬細小病毒(Porcine parvovirus,PPV)、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV-2)、日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)和CSFV各一段保守序列制備成探針集成到一張芯片上,制備成低密度檢測基因芯片,可以同時檢測到樣品中的6種病毒及病毒核酸的存在情況。張煥容等[14]在前人研究基礎之上,制備了PRV、PPV和JEV 3種引起豬繁殖障礙的病毒性傳染病檢測基因芯片并進行了該基因芯片的檢測方法研究,結果表明PRV-PPV-JEV檢測基因芯片具有良好的特異性,且該檢測系統(tǒng)的靈敏度高達3 pg/μ L。高金拽等[15]將PPV、PCV-2、CSFV分別應用生物信息學方法,針對病毒基因組保守序列設計特異性強的60mer寡核苷酸探針,并將其按所設計陣列固定于表面經氨基化修飾的玻片上,制備出寡核苷酸芯片用于臨床診斷,實驗結果表明,幾種病毒基因的檢測探針都能特異性地與相應樣品雜交,能檢測到較強的陽性熒光信號,而空白對照和陰性對照基本不能檢測到熒光信號。Baner M K等[16]報道了區(qū)別由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)、豬水皰病病毒和水皰性口炎病毒引起的豬在臨床上的相同癥狀的鑒別基因芯片,對代表3個不同病毒的不同來源的39個cDNA樣品進行了分析,取得了與PCR鑒定方法完全一致的結果。通過利用基因芯片,為大批量快速診斷、普查豬病毒性疫病提供了保證。

2.2 基因分型中基因芯片的應用

豬病毒存在多樣性,不同的病毒型別有著不同的疾病譜、流行特點、地理分布及與其宿主特定的共進化關系等,常見的如FMDV、SIV、PRRSV等。因此,病毒進一步分型對指導防治實踐有著極為重要的意義。目前,用于病毒基因分型的方法除了型和亞型特異性PCR之外[17],還有寡核苷酸指紋圖譜技術、核酸序列分析法、限制性片段長度多態(tài)性分析法、限制性核酸內切酶分析、異源雙鏈泳動法、單鏈構象多態(tài)性、基因組片段長度多態(tài)性、核酸雜交法、基因芯片法等。其中基因分型芯片具有靈敏度高,且雜交洗滌后直接掃描,操作簡便等突出優(yōu)點[18]。

Liu Y C等[19]設計的檢測PRRSV和FMDV的基因芯片模型。以O型FMDV的VP1結構基因作為一個長信號序列,鑒定了23個不同F(xiàn)MDV株為代表的所有7個血清型。Baner J等[20]設計的一種微陣列芯片,使用的口蹄疫DNA芯片是從正常病毒和特異的血清型基因組VP1-VP3-2A獲得的,檢測了23個不同的FMDV株代表所有7個血清型并對其進行分型,建立了在單一芯片上進行口蹄疫鑒定和分型的基因芯片技術。

姜永厚等[21]應用寡聚核苷酸基因雜交技術建立了一種快速可靠的檢測PCV基因型的方法。他們在PCV保守序列復制酶基因內設計了2對特異性引物,在此物之間設計了2種基因型特異的核苷酸探針(22 mer～30 mer)。通過PCR擴增Cy5標記的DNA片段與固定在玻片表面的探針雜交進行PCV基因分型。該技術很好的結合了PCR方法的高度敏感性和DNA-DNA雜交技術的選擇特異性,其檢測的結果與Calsamiglia M等[22]相一致。陳紅軍等人根據(jù)流感病毒的HA和NA基因序列間的差異性,采用基因芯片技術,借助多重PCR和核酸標記技術,構建了SIV亞型分型基因芯片,用于SIV亞型的分型,具有檢測A型流感病毒和同步鑒別豬流感病毒H1、H3、H9、N1和N2亞型的功能。研究表明,基因芯片用于病毒的基因分型有很多潛在的優(yōu)勢,還有待于進一步的發(fā)展。

2.3 表達譜分析中基因芯片的應用

在表達譜分析中,對來源于不同個體、不同組織、不同細胞周期、不同發(fā)育階段、不同分化階段、不同病變、不同刺激下的細胞內的mRNA或逆轉錄后產生的cDNA與芯片上的基因片段進行雜交,可以對這些基因表達的個體特異性、組織特異性、發(fā)育階段特異性、分化階段特異性、病變特異性、刺激特異性進行綜合的分析和判斷,從而將某個或幾個基因與疾病聯(lián)系起來,確立相關基因功能以及基因與基因間的相互作用關系[23]。目前表達譜基因芯片在獸醫(yī)學研究領域中已逐步得到應用,并呈現(xiàn)出了其強大的功效,通過檢測基因表達水平差異,為闡明不同狀況下的基因功能,推斷基因與基因的相互關系,揭示基因與疾病的內在聯(lián)系并發(fā)現(xiàn)可能的診斷及藥物作用靶基因等方面提供了有力的工具。

袁建琴等[24]已經通過同種組織RNA自身比較試驗及不同組織RNA的差異分析試驗對CSFV cDNA芯片實驗的重復性進行檢驗,并對cDNA芯片數(shù)據(jù)的可靠程度,對cDNA芯片試驗數(shù)據(jù)作了整體的評估。結果證實,該芯片系統(tǒng)得到的CSFV cDNA表達譜數(shù)據(jù)相關系數(shù)一般大于0.9,假陽性率控制在2%以內,具有很大的臨床參考價值。

3 存在的問題及應用前景

基因芯片技術作為一項新誕生的技術,它也同樣有許多問題需要解決。有學者指出基因芯片技術作為一種預測手段還不穩(wěn)定,應慎重選擇[25]。首先該技術需要大量的已測知的、準確的DNA、cDNA片段的信息,充分利用這些信息才能使芯片技術成為大規(guī)模、集成化、整體獲取生物信息的有效手段,現(xiàn)在尚缺乏公開可得的、經證實準確的基因序列。其次是目前研究芯片技術的費用還比較高昂,盡管芯片或微陣列可以重復多次使用,但每次雜交反應后,其敏感性都要降低。此外,樣品制備和標記還比較復雜,各研究機構中仍沒有一個統(tǒng)一的質量控制標準,各實驗室不能分享數(shù)據(jù)和資料庫等。這些問題已開始為許多研究者所關注。

基因芯片技術作為一種先進的、大規(guī)模、高通量檢測技術,成為疾病診斷的尖端核心技術之一。其優(yōu)點表現(xiàn)在:①高度的靈敏性和準確性;②快速簡便;③可同時檢測多種病原。然而,傳統(tǒng)的芯片平臺因基于熒光標記技術,應用時需要昂貴的掃描設備以及操作復雜[26],技術要求高,在獸醫(yī)臨床應用中一直難以推廣普及。隨著功能基因組學和蛋白組學研究的深入和芯片技術的完善,一種易于在基層醫(yī)療單位推廣使用,能夠有效地解決傳統(tǒng)基因芯片在應用過程中,需要大型檢測設備、不便于推廣的瓶頸問題的既經濟又可靠的新型基因芯片技術必將誕生,這一新的技術革命一定會在生命科學和相關領域發(fā)揮巨大的作用。

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