魯改儒,張艷英,孟立根

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)中獸醫(yī)學(xué)院,河北定州073000;2.河北師范科技學(xué)院,河北秦皇島066000)

雞傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)于1957年首次在美國特拉華州南部的甘布羅(Gumboro)地區(qū)發(fā)現(xiàn)(又稱甘布羅病)[1]。該病現(xiàn)己呈全球性流行,據(jù)調(diào)查美國雞群的血清陽性率近100%,南美為90%,荷蘭為88%,意大利為76%,日本約為75%,德國為61.50%[2]。目前IBD在我國已傳遍各地,某些地方發(fā)病率高達80%以上,病死率在30%～70%或以上[3]。IBDV主要侵害4周齡～6周齡的雛雞,破壞雞的體液免疫器官——法氏囊,它主要破壞法氏囊中正在分化成熟的B淋巴細胞,引起雞的急性發(fā)病甚至死亡,亞臨床感染雞和康復(fù)雞可產(chǎn)生免疫抑制和生長抑制[4-5],增加了對新城疫、馬立克病和傳染性支氣管炎等的敏感性[6]。1987年,一種以高發(fā)病率和高病死率為特征的IBDV超強度(vvIBDV)或高致病力IBDV(hvIBDV)毒株陸續(xù)在荷蘭、英國、比利時、德國、日本等國家報道,辛桂香等報道我國也存在著這種vvIBDV[7]。多數(shù)學(xué)者認為vvIBDV是引起雞IBD免疫失敗的主要因素。近年來由于變異株和超強毒株的不斷出現(xiàn),免疫失敗時有發(fā)生,給IBD的防控帶來了極大的困難[8-10]。IBDV感染火雞、鴨、雛鵝、鴕鳥、灰天鵝、雉雞等的病例也相繼有報道,因此本病己成為危害世界養(yǎng)禽業(yè)最嚴重的傳染病之一。

近年來,IBD流行出現(xiàn)了一些新的特點:病死率比過去增高,過去一般在10%以下,現(xiàn)在一般為13%～50%,超強毒株病死率高者可達94%[11];IBD流行多在使用本病弱毒疫苗4 d～7 d后發(fā)病;IBD的流行不僅抑制或降低了雛雞對多種疫苗(尤其是新城疫疫苗)的免疫應(yīng)答,而且提高了雞對某些微生物的易感性[12]。

本病主要是通過發(fā)病情況、臨床癥狀、病理剖檢進行臨床診斷,對流免疫電泳和PCR技術(shù)等實驗室方法可鑒定毒株的類型,以指導(dǎo)臨床正確選擇疫苗,進行科學(xué)的免疫預(yù)防和有效控制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 秦皇島某養(yǎng)雞場送檢的4周齡蛋雞8只。

1.1.2 試劑 1 000 IU/mL青鏈霉素,雞傳染性法氏囊病標準抗原(效價1∶64)(哈爾濱獸醫(yī)研究所),標準陽性血清(效價1∶128)(哈爾濱獸醫(yī)研究所),PBS緩沖液,巴比妥緩沖液(pH 8.6、離子強度0.05m ol/L),15 g/L瓊脂糖、蛋白酶K(北京欣源佳和生物有限公司),100 g/L十二烷基硫酸鈉(SDS),飽和酚(批號20081214),氯仿∶異戊醇(24∶1),TE緩沖液(pH 8.0),70%乙醇(天津市凱通化學(xué)試劑有限公司,批號20090215),無水乙醇(天津市凱通化學(xué)試劑有限公司,批號20081205),RT buffer(反應(yīng)緩沖液),DTT(二硫蘇糖醇,上海前塵生物科技有限公司),dNTP(三磷酸脫氧核糖核苷,上海前塵生物科技有限公司),ddH2O(去離子水),反轉(zhuǎn)錄酶M-M uLv(MBI公司),RNA sin(RNA酶抑制劑,華美生物工程公司),Taq DNA聚合酶(寶生物工程(大連)有限公司),瓊脂糖(上海Yito企業(yè)有限公司)。

1.1.3 實驗動物 SPF雞購于梅里亞維通實驗動物中心。易感雞購自秦皇島市徳寬種雞孵化場。

1.2 方法

1.2.1 擴增VP2高變區(qū)的引物設(shè)計方案 P1:5′-TCACCGTCCTCAGCTTAC-3′,對應(yīng)于ORFA-1第495位到512位核苷酸,長18 bp;P2:5′-TCAGGATTTGGGATCAGC-3′,互補于ORFA-1第1 120位到1 137位核苷酸,長18 bp;P3:5′-GCCCAGAGTCTACACCATAACTGC-3′,對應(yīng)于ORFA-1第607位到630位核苷酸,長24 bp;P4:5′-GCGACCGTAACGACAGATCC-3′,互補于ORFA-1第1 081位到1 100位核苷酸,長20 bp;以P3、P4為引物,所得擴增產(chǎn)物應(yīng)為494 bp。由張艷英老師提供。

1.2.2 病毒分離與篩選

1.2.2.1 病料處理 采集病變典型的法氏囊,以1∶3加入滅菌的PBS緩沖液,勻漿機制成乳劑,經(jīng)反復(fù)凍融3次后以3 000 r/min離心10m in,取上清液備用。

1.2.2.2 病毒篩選分離 用10 g/L瓊脂糖凝膠對流免疫電泳(CIE)試驗,對1.2.1.1中制備的囊上清液進行篩選分離。將勻漿上清液依次判定結(jié)果。

將對流免疫電泳試驗陽性的法氏囊上清液,加入1 000單位/mL青、鏈霉素作用2 h～4 h后,滴鼻、點眼接種4周齡SPF雞0.2mL/只,接種后72 h取出感染雞法氏囊,制備上清液(方法同1.2.2.1)。

1.2.3 病毒鑒定

1.2.3.1 套式RT-PCR擴增與氨基酸序列分析

病毒RNA提取。移取1.2.2.1中制備的囊勻漿上清0.5 mL,加入蛋白酶K至終濃度100μg/mL,100 g/L SDS至終濃度5 g/L,50℃消化1 h～2 h。等體積酚(水飽和),氯仿∶異戊醇(24∶1)各抽提1次,上層水相用2.5倍無水乙醇沉淀。沉淀用700mL/L乙醇洗2次,空氣干燥后重懸于20μL pH 8.0TE緩沖液。

反轉(zhuǎn)錄(RT)。5×反應(yīng)緩沖液4μL,DTT 2μL,P1 0.5μL(25 pmol),dNTP(10 mmol/L)1μL,病毒RNA 1μL,ddH2O 10μL?；靹?沸水中煮10 min,立即置冰浴冷卻至室溫,加入M-MuLV(200 U/μL,寶靈曼公司)0.5μL,RNasin(華美公司)1μL?；靹?瞬時離心,42℃保溫1 h。95℃5min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。

PCR擴增與鑒定。10×PCR緩沖液5μL,dNTP(10 mm ol/L)1μL,P1 1μL(50 pmol),P2 1μL(50 pm ol),RT產(chǎn)物5μL,ddH 2 O 36.5μL,Taq酶(5 U/μL)0.5μL(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室提供)。混勻,進入PCR循環(huán):94℃30 s;94℃30 s,55℃30 s,72℃30 s,30個循環(huán);72℃延伸10 min。取10μL反應(yīng)產(chǎn)物,10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

套式PCR(nested-PCR)擴增與鑒定。以上述RT-PCR擴增的產(chǎn)物為模板,在內(nèi)部引物P3、P4引導(dǎo)下,對目的產(chǎn)物進行進一步的擴增,反應(yīng)條件如下:10×PCR緩沖液5μL,dNTP(10mmol/L each)1μL,P3 1μL(50pmo l),P4 1μL(50 pmol),上述PCR產(chǎn)物0.5μL,ddH2O 41.0μL,Taq酶0.5μL(5 U/μL)。混勻,進入PCR循環(huán):94℃30 s;94℃30 s,60℃30 s,72℃30 s,30個循環(huán);72℃延伸10 min。取10μL反應(yīng)產(chǎn)物,10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

氨基酸序列分析。將Nested-PCR擴增產(chǎn)物進行測序。根據(jù)測定的IBDV VP2高變區(qū)cDNA序列,采用GENEman和DNA Star計算機系統(tǒng)推導(dǎo)編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列,并進行分析比較。

1.2.3.2 回歸試驗 取上述法氏囊上清液,經(jīng)滴鼻和口服途徑感染21日齡～25日齡健康易感雞8只,對照雞4只,接種0.5mL/只,在感染后48 h～72 h剖檢觀察并記錄。

2 結(jié)果

2.1 對流免疫電泳法

被檢抗原(1.2.2.1中制備的囊上清液)8羽份,抗原孔與抗體孔均出現(xiàn)明顯沉淀線。結(jié)果為陽性。

2.2 套式RT-PCR擴增與氨基酸序列分析

經(jīng)套式PCR再次擴增后,取5μL反應(yīng)產(chǎn)物電泳檢測。在約490 bp大小處,被檢毒株均可見一條與預(yù)期的產(chǎn)物大小相符的條帶,而且陰性對照和空白對照均沒有條帶出現(xiàn),符合預(yù)期結(jié)果(圖1)。

根據(jù)高變區(qū)內(nèi)氨基酸同源性,用平均距離法和聚類程序PXD,作出秦皇島毒株與已發(fā)表的國際標準強毒株的親緣關(guān)系樹狀圖譜(圖2)。從樹狀圖上比較容易發(fā)現(xiàn),HeB-qhd與超強毒株OKYM,UK 661,DV 86最相近同源性高達100%,具有強毒特征的毒株HeB-qhd與V 3、V 2親緣關(guān)系較近(97.9%～99.3%)。對收集的毒株進行了VP2高變區(qū)序列分析,和有關(guān)文獻報道的超強毒株進行了對照,發(fā)現(xiàn)H eB-qhd毒株具備了超強毒的3個典型的特征:①249位和254位的氨基酸分別為Q和G,而非K和S,從而保證其抗原性不發(fā)生變異;②七肽區(qū)保守SWSASGS不變,且279位和284位氨基酸分別為D和A,而非N和T;③222、294、299位具有3個特征性氨基酸,分別為A、I和S,這3個氨基酸使得超強毒株的親和性發(fā)生變化,從而導(dǎo)致毒力大大增強。通過比較分析待檢毒株為超強毒株。

圖1 VP2高變區(qū)的反轉(zhuǎn)錄PCR/套式PCR擴增產(chǎn)物Fig.1 VP2 hypervariab le region of RT-PCR/nest RT-PCR

圖2 秦皇島IBDV毒株與已發(fā)表的國際標準強毒株的氨基酸序列樹狀圖Fig.2 The am ino acid sequen ce tree of Qinhuangdao IBDV strains and the in ternational standard virulent strains

本試驗所測秦皇島毒株其主要的氨基酸變化同幾個國際上標準強毒株的VP2高變區(qū)推測的氨基酸序列見表1。

表1 秦皇島IBDV分離株與參考毒株在VP2高變區(qū)的特征性氨基酸Table 2 The characteristic amino acids of Qinhuangdao IBDV isolate and reference strains in the VP2 hypervariable region

2.3 回歸試驗

人工接種21日齡～25日齡易感雞36 h開始發(fā)病,8只試驗易感雞全部發(fā)病,4只對照雞不發(fā)病,發(fā)病雞排出灰白色稀糞,羽毛蓬松、戰(zhàn)栗。剖檢可見,法氏囊黏膜嚴重出血,呈“紫葡萄”樣外觀,剖開可見出血或有淡黃色的膠凍樣滲出液。腿部、胸部肌肉有嚴重出血,腺胃與肌胃交界處出現(xiàn)嚴重的帶狀出血。

3 討論

近年來,IBD的流行出現(xiàn)了新的特點,其臨床癥狀及病變不典型,免疫失敗現(xiàn)象較為常見,超強毒(vvIBDV)成為主要流行毒株。因此,對本病的早期確診就顯得尤為重要。目前用于檢測IBDV的方法有瓊脂擴散試驗(AGP)、對流免疫電泳(CIE)、間接血凝試驗、ELISA、中和試驗和PCR技術(shù)等,但由于試驗條件和試驗成本等因素限制,只有免疫擴散法真正得到推廣應(yīng)用。瓊脂擴散法雖然簡便易行,但其敏感性和特異性都不高,而且必須在試驗后24 h～48 h才能觀察結(jié)果。

對流免疫電泳(CIE)是將雙向免疫擴散與電泳相結(jié)合的一種技術(shù)。用CIE試驗,抗原和抗體分別受電泳力和電滲力的作用呈定向相對泳動,既加速了反應(yīng)的出現(xiàn),也限制了抗原和抗體向四周自由擴散的傾向,因而提高了敏感性。用CIE方法只需30 min～60 min就出結(jié)果,而且特異性高,重復(fù)性好,檢測效果明顯好于瓊擴法。

PCR技術(shù)作為RNA病毒的一種特異診斷方法,具有快速、特異、靈敏等特點。RNA酶在環(huán)境中無處不在,為防止操作過程中提取RNA不被環(huán)境中的RNA酶降解,試驗在操作過程中嚴格無菌,操作人員戴一次性口罩、帽子、手套,實驗過程中手套要勤換。本試驗在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上進行優(yōu)化,擴增效果理想,采用外引物、內(nèi)引物進行套式RT-PCR,靈敏性和特異性較好。所以可用該方法進行臨床樣品快速診斷雞傳染性法氏囊病,并對該病的流行病學(xué)調(diào)查有重大意義。

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