楊 穎,夏 夢(mèng),殷俊磊,毛君婷,杜海燕,周碧君,文 明*

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,貴州貴陽510000;2.湘西自治州種畜場(chǎng),湖南吉首416000)

鴨病毒性腸炎(Duck viral enteritis,DVE)又稱鴨瘟(Duck plague,DP),是由鴨腸炎病毒(Duck enteritis virus,DEV)引起鴨、鵝和其他雁形目禽類的一種急性熱性敗血性傳染病,其特征是血管損傷、體腔溢血、消化道出血、壞死、淋巴器官受損和實(shí)質(zhì)器官退行性變化等[1-2]。本病自1923年首次報(bào)道以來,廣泛流行于養(yǎng)鴨國家和地區(qū),具有較高的發(fā)病率和死亡率,給養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3-5]。

DEV為皰疹病毒科禽皰疹病毒Ⅰ型成員,對(duì)感染宿主體內(nèi)各器官組織具有泛嗜性。近年來,許多學(xué)者對(duì)DEV的形態(tài)發(fā)生學(xué)、快速檢測(cè)方法以及分子生物學(xué)等方面進(jìn)行了大量的研究,并取得了較大的進(jìn)展;同時(shí)也采用多種方法進(jìn)行了DEV在感染鴨體內(nèi)的分布規(guī)律研究,但對(duì)DEV的致病機(jī)理尚未完全闡明[6-10]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是近年來發(fā)展較快的一種PCR技術(shù),具有較高的特異性和敏感性,可以實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)的目的[11-12]。本試驗(yàn)根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的特點(diǎn),選用SYBR GreenⅠ模式,對(duì)人工感染雛鴨體內(nèi)的DEV動(dòng)態(tài)分布規(guī)律進(jìn)行了檢測(cè)研究,以期為DEV的致病機(jī)理和病理診斷技術(shù)研究提供一些理論依據(jù)和試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株與試驗(yàn)用動(dòng)物 試驗(yàn)用毒株為鴨腸炎病毒強(qiáng)毒GZ株,由筆者所在實(shí)驗(yàn)室鑒定保存。試驗(yàn)用鴨為不含DEV抗體的15日齡健康雛鴨,購自貴陽某鴨場(chǎng)。

1.1.2 主要試劑和儀器 Universal Genomic DNA Ex traction Kit Ver.3.0(DV 811A)及SYBR·Premix Ex TaqTM(DRR041A)購于寶生物工程(大連)有限公司;FQD-48 Line-Gene 3000實(shí)時(shí)定量PCR儀,為杭州博日有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank上DEV-NP基因序列(登錄號(hào):DQ072725)的保守區(qū)域,設(shè)計(jì)并合成一對(duì)特異性引物,即上游引物為N1:5′-CGTCAACGCTATGCTACCATC-3′,下游引物為N2:5′-CATCTGCCATCACCAGTTCTG-3′,理論擴(kuò)增片段大小為335 bp,引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.2.2 SYBRGreenⅠPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 按試劑盒方法提取DEV強(qiáng)毒GZ株的病毒DNA后,取適量DNA模板做連續(xù)10倍倍比稀釋(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7),以不同稀釋度的DEV DNA樣本為模板進(jìn)行SYBR Green IPCR反應(yīng),建立熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。病毒DNA模板拷貝數(shù)的計(jì)算公式為:模板拷貝數(shù)=(DEV DNA模板濃度×阿氏常數(shù))/(堿基平均分子質(zhì)量×DEV DNA模板總長度),其中DNA濃度通過測(cè)定OD260nm值后計(jì)算得到;阿氏常數(shù)為6.02×1023;堿基平均分子質(zhì)量為660 u;DEV DNA模板總長度約為150 kb。

PCR采用25.0μL反應(yīng)體系,按(DRR041A)使用說明書添加,即SYBR·Prem ix Ex TaqTM(2×)12.5μL、上/下游引物(10μmol/L)各0.5μL和模板DNA 2.0μL,最后補(bǔ)ddH 2O至25μL。反應(yīng)條件為95℃30 s、95℃5 s和60℃30 s,共40個(gè)循環(huán);每個(gè)循環(huán)結(jié)束后,于60℃收集熒光信號(hào)1次,繪制DNA模板的擴(kuò)增曲線和熒光定量PCR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 雛鴨人工感染及樣品采集 將60只15日齡雛鴨隨機(jī)分成2組,第1組為人工感染組計(jì)36只,采用腿部肌肉注射接種DEV病毒液,0.1mL/只;第2組為空白對(duì)照組計(jì)24只,不進(jìn)行任何處理,隔離飼養(yǎng)。于第3、6、10、18、30、48、72、96、108 h(死亡)剖殺雛鴨,無菌采集腦、肝、脾、腎、十二指腸、胸腺、胸肌、盲腸、心、肺等組織樣本(其中每個(gè)時(shí)段人工感染組剖殺3只鴨,空白對(duì)照剖殺2只鴨)分別編號(hào)并裝于滅菌平皿,置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 感染雛鴨體內(nèi)組織中病毒DNA的SYBR G reen IPCR檢測(cè) 無菌分別稱取上述采集的雛鴨組織樣品,于研缽(每個(gè)樣品一個(gè)研缽)充分研磨后,加入ddH 2O(按1 g樣本2mL PBS緩沖液)混勻,倒入無菌Eppendorf管中,3 000 r/min離心10 m in,取上清液200μL,按Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0(DV 811A)使用說明書提取DEV DNA,取2.0μL作為SYBRG reenⅠPCR的反應(yīng)模板,按上述方法進(jìn)行SYBR GreenⅠ模式Real-time PCR擴(kuò)增,檢測(cè)各組織中DEV DNA含量。

2 結(jié)果

2.1 SYBRGreenⅠPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

選取DEV DNA的6個(gè)稀釋度(10-2～10-7)作為模板同時(shí)進(jìn)行Real-time FQ-PCR擴(kuò)增,結(jié)果可見PCR擴(kuò)增曲線呈典型的S型,且指數(shù)增長期、線性增長期和平臺(tái)期明顯(圖1);調(diào)整增閾值與基線配比,確定Ct值,轉(zhuǎn)換得出SYBR GreenⅠ模式Realtime PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2),經(jīng)計(jì)算線性循環(huán)數(shù)與DNA模板濃度的相關(guān)系數(shù)達(dá)0.999,表明本試驗(yàn)建立的SYBRGreenⅠPCR檢測(cè)誤差較小,可以用于臨床樣本的檢測(cè)。

圖1 不同稀釋度(10-2～10-7)DNA模板的Real time PCR擴(kuò)增曲線Fig.1 Real-time PCR amplification curve of the different diluted DNA

圖2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard cu rve of Real-time FQ-PCR

2.2 DEV強(qiáng)毒株在人工感染雛鴨體內(nèi)增殖規(guī)律的檢測(cè)結(jié)果

以DEV強(qiáng)毒經(jīng)腿部肌肉注射15日齡雛鴨,在感染后不同時(shí)間剖殺,采集雛鴨不同組織提取病毒DNA樣本,應(yīng)用建立的SYBR Green I模式Realtime PCR進(jìn)行定量檢測(cè),結(jié)果顯示,感染后3 h即可在肝、脾、腦、胸腺、腎和肺等6種器官組織中檢出DEV核酸;感染后6 h,除上述組織外還可在十二指腸和盲腸中檢測(cè)出病毒核酸;感染10 h后又可在心肌和胸肌中檢出,而空白對(duì)照組鴨各個(gè)受檢樣品在不同時(shí)段上,均呈陰性反應(yīng)(圖3)。同時(shí)發(fā)現(xiàn),不同受檢組織在感染時(shí)間內(nèi)DEV DNA含量有所不同,總體趨勢(shì)(由高到低)為腦、肝、脾、胸腺、腎、十二指腸、盲腸、肺、胸肌和心肌。

圖3 人工感染鴨各組織中DEV的動(dòng)態(tài)分布Fig.3 Dynamic distribution of virus in tissues of ducks infected with DEV

3 討論

鴨病毒性腸炎(鴨瘟)是危害水禽養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的重要傳染病之一,許多學(xué)者對(duì)其病原鴨腸炎病毒(DEV)進(jìn)行深入研究,取得了較大的進(jìn)展;也有部分學(xué)者采取免疫組化、普通PCR等實(shí)驗(yàn)技術(shù)對(duì)感染鴨體內(nèi)DEV的分布規(guī)律進(jìn)行了研究[6-10],但對(duì)DEV的致病機(jī)理尚未得到完全的闡明。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是近年來發(fā)展起來的一種新型PCR技術(shù),與普通PCR技術(shù)相比,可以實(shí)時(shí)觀察擴(kuò)增結(jié)果,避免了普通PCR的電泳與染色過程,減少了交叉污染的可能性,并且可以定量檢測(cè),整個(gè)過程約需3.5 h,具有簡單、準(zhǔn)確、快速等優(yōu)點(diǎn),故很快得到廣泛的應(yīng)用,如病原快速鑒定、DNA拷貝數(shù)檢測(cè)、單核苷酸多態(tài)性(SNPs)分析以及m RNA表達(dá)研究等。因此,也有部分學(xué)者應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)DEV的增殖、分布及排泄等方面進(jìn)行了研究[13-15]。

本試驗(yàn)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的特點(diǎn),采用SYBR GreenI模式PCR檢測(cè)人工感染雛鴨體內(nèi)DEV強(qiáng)毒的動(dòng)態(tài)分布,結(jié)果發(fā)現(xiàn)DEV含量在感染雛鴨體內(nèi)的分布時(shí)間具有一定的規(guī)律性,即較早檢出病毒DNA的是肝、脾、腦、胸腺、腎和肺組織,其病毒含量也相對(duì)較高,而其他組織檢出時(shí)間相對(duì)晚些,且病毒含量也相對(duì)較少。這可能由于經(jīng)肌肉注射感染后,DEV通過血液循環(huán)首先達(dá)到肝后,再經(jīng)血液循環(huán)散布到全身各處組織器官。這與Yuan G P等[16]對(duì)DEV強(qiáng)毒感染后鴨組織器官的電鏡觀察結(jié)果基本一致。從感染鴨組織器官中的病毒含量看,在肝、脾和腦中相對(duì)較高,且檢出時(shí)間也較早,提示這些器官組織是DEV的主要靶器官,也是進(jìn)行病毒分離與檢測(cè)的最佳采樣部位。上述結(jié)果顯示,進(jìn)行感染動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行病毒增殖與分布動(dòng)態(tài)變化的定量檢測(cè),對(duì)揭示病毒的致病機(jī)理及病毒與機(jī)體間相互作用是十分必要且非常有用的[17-18]。

本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),感染后3 h即可在感染雛鴨肝、脾、腦、胸腺、腎和肺等6種組織中檢出DEV DNA;而一般在感染后36 h雛鴨才開始表現(xiàn)出一定的臨床癥狀,如精神沉郁、食欲減退、體溫升高等。由此可見,應(yīng)用SYBR Green I模式實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),可及時(shí)對(duì)染病家禽及其產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè),有利于DEV疫情的早期發(fā)現(xiàn)和有效控制。

[1] 卡爾尼克BW.禽病學(xué)[M].10版.高 福,蘇敬良,譯.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,1999:857-867.

[2] 甘孟侯.中國禽病學(xué)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,1997:109-119.

[3] 殷 震,劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)[M].2版.北京:科學(xué)出版社,1997:1073-1077.

[4] Kaleta E F.Herpesviruses of birds:A view[J].Avian Pathol,1990,19:193-211.

[5] Weingarten M.Duck plague:clinical aspects,diagnosis,control[J].Trerarztl Prax,1989,17(1):53-56.

[6] 楊曉燕,羅 薇,齊雪峰.應(yīng)用PCR檢測(cè)成年鴨體內(nèi)鴨瘟強(qiáng)毒的分布[J].中國獸醫(yī)科技,2004,34(1):66-69.

[7] 劉 菲,程安春,汪銘書,等.鴨瘟病毒強(qiáng)毒株在急性人工感染成年鴨病例體內(nèi)分布規(guī)律[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào),2004,24(3):228-230.

[8] 程安春,汪銘書,劉 菲,等.鴨瘟病毒弱毒株在免疫雛鴨體內(nèi)的分布和排毒規(guī)律[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào),2005,25(3):231-233,258.

[9] 胡薛英,谷長勤,程國富,等.應(yīng)用單克隆抗體的免疫組織化學(xué)法研究雛鴨體內(nèi)鴨瘟病毒的分布[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2006,28(3):320-322.

[10] 徐 超,程安春,汪銘書,等.間接酶免疫組化檢測(cè)DPV在感染鴨體內(nèi)細(xì)胞定位的研究與應(yīng)用[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào),2007,27(5):640-644.

[11] 朱水芳.實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)技術(shù)[M].北京:中國計(jì)量出版社,2003:89-115.

[12] 韓俊英,曾瑞萍.熒光定量PCR技術(shù)及其應(yīng)用[J].國外醫(yī)學(xué):遺傳學(xué)分冊(cè),2000,23(3):117-120.

[13] 岳 華,楊發(fā)龍,景 波,等.鴨瘟病毒在雛鴨體內(nèi)的動(dòng)態(tài)定量分布及其潛伏部位研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2007,29(9):671-675.

[14] 齊雪峰,程安春,汪銘書,等.應(yīng)用Taq Man-MGB探針FQPCR探討鴨瘟弱毒苗在鴨體內(nèi)的分布及排泄規(guī)律[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào),2008,28(7):766-770.

[15] 楊曉燕,程安春,汪銘書,等.鴨瘟病毒強(qiáng)毒株在感染鴨實(shí)質(zhì)器官內(nèi)的增殖與分布[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào),2008,28(11):1254-1258.

[16] Yuan G P,Cheng A C,Wang M S,et al.Electron microscopic studies of the morphogenesis of duck enteritis virus[J].Avian Dis,2005,49:50-55.

[17] Massimo C.Quantitative molecular analysis of virus expression and replication[J].J Clin Microbiol,2000,38(6):2030-2036.

[18] MackayIM,Arden K E,Nitsche A.Real-time PCR in virology[J].Nucleic Acid s Res,2002,30(6):1292-1305.