李曉峰,張 銳

（1.吉林省人民醫(yī)院,吉林 長春 130021;2.吉林省肝膽病醫(yī)院）

本試驗(yàn)采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（fluorescence quantitativePCR,FQ-PCR）法檢測人巨細(xì)胞病毒（HCMV）DNA,并探討其在HCMV感染診斷和治療中的應(yīng)用價值。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源 120例HCMV總抗體陽性的肝病患者標(biāo)本來源于我院門診及住院患者;80例確診HCMV感染的新生兒標(biāo)本及146例疑似HCMV感染的孕婦標(biāo)本來源于長春市婦產(chǎn)科醫(yī)院。?

1.1.2 試劑和儀器 HCMV-IgM檢測試劑盒購自北京肝炎試劑研制中心;PP65抗原檢測試劑盒購自中山大學(xué)達(dá)安基因診斷中心;HCMV-DNA熒光定量PCR檢測試劑盒購自中山大學(xué)達(dá)安基因診斷中心;7000Sequence Detection System核酸擴(kuò)增儀（深圳匹基公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 血清HCMV-IgM ELISA法。

1.2.2 PP65抗原 肝素抗凝血,淋巴細(xì)胞分離液分離白細(xì)胞,按照試劑盒說明書流式細(xì)胞儀檢測PP65抗原。

1.2.3 FQ-PCR檢測血清HCMV DNA 嚴(yán)格按照說明書提取DNA及PCR擴(kuò)增。每次試驗(yàn)嚴(yán)格按照試劑盒提供的陽性標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線,試驗(yàn)設(shè)陰性、陽性及空白對照。

1.2.4 統(tǒng)計分析 對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行 χ2檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCMV-IgM、PP65抗原和 HCMV DNA檢測結(jié)果

不同來源標(biāo)本HCMV-IgM、PP65抗原和HCMV DNA檢測結(jié)果見表1,其中HCMV總抗體陽性的肝病患者標(biāo)本HCMV-DNA拷貝數(shù)為3.27×103-9.67×108copies/m l;確診HCMV感染的新生兒標(biāo)本標(biāo)HCMV DNA拷貝數(shù)為2.38×103-2.12×108copies/ml;疑似HCMV感染的孕婦標(biāo)本HCMV DNA拷貝數(shù)為1.27×103-8.79×108copies/ml。?

2.2 HCMV DNA含量與病情、預(yù)后的關(guān)系

87例HCMV-DNA陽性肝炎患者中有12例拷貝數(shù)大于1.0×107copies/ml,且癥狀久治不愈。

61例HCMV-DNA陽性的HCMV-IgM陰性的孕婦9例發(fā)生了HCMV的宮內(nèi)傳播,17例HCMV-DNA拷貝數(shù)大于1.0×107copies/m l。

表1 不同來源標(biāo)本HCMV-IgM、PP65抗原和HCMV DNA檢測結(jié)果

54例HCMV-DNA陽性的新生兒中,有8例拷貝數(shù)大于1.0×107copies/ml,其中6例癥狀重,病程長,并伴有智力低下、小頭畸形和聽力異常等后遺癥。

3 討論

HCMV感染是廣泛存在于人群中的一種病毒性疾病,可引起先天或后天性感染,有兩種類型,一種為唾液腺的不顯性感染或慢性感染而長期存留;另一種為全身性疾病,為巨細(xì)胞包涵體病,主要侵犯嬰兒。本研究檢測不同標(biāo)本HCMV-IgM、PP65抗原和HCMV-DNA,結(jié)果顯示226例HCMV-DNA陽性患者中有128例HCMV-DNA-IgM陰性,提示抗體檢測作為感染的間接指標(biāo),不可避免的存在檢測的窗口期問題,只有在感染或者復(fù)發(fā)后2-4周后才能檢測到,陰性結(jié)果也不能排除感染,并不適合早期診斷。

巨細(xì)胞病毒感染最長用于抗原檢測的是抗原PP65,它是HCMV活動性感染的早期標(biāo)志性產(chǎn)物。Grefte[1]等證實(shí):PP65是有HCMV病毒UL83編碼的被膜蛋白,分子量65000,當(dāng)病毒感染宿主細(xì)胞后該抗原即表達(dá),病毒活躍時明顯增加。PP65檢測是目前檢測HCMV活動性感染和指導(dǎo)抗病毒治療的重要方法,其靈敏度和特異性均較高,但由于方法學(xué)上的特殊,完成全過程受諸多因素影響,包括標(biāo)本必須采集當(dāng)天處理,因此很難做到高通量檢測,抗污染能力也不強(qiáng),抗原檢測受到限制。定性PCR對HCMV的排除率較高,但定性PCR不能區(qū)別潛伏感染和活動性感染[2]。

熒光定量PCR是通過熒光信號的定量監(jiān)測來實(shí)現(xiàn)對PCR過程中產(chǎn)物的監(jiān)測,并精確計算出PCR初始模板量,融合了PCR的敏感性、DNA雜交的特異性和光譜技術(shù)精確定量等優(yōu)點(diǎn)。熒光定量PCR與PP65抗原檢測有較好的一致性,HCMV-DNA水平與抗原血癥水平相對應(yīng)[3、4]。本研究結(jié)果顯示87例HCMV-DNA陽性肝炎患者中有12例拷貝數(shù)大于1.0×107copies/ml,且癥狀久治不愈,提示HCMV感染可能是加重肝病且久治不愈的原因之一。146例疑似HCMV感染的孕婦HCMV-DNA檢測有85例陽性,提示應(yīng)用熒光定量PCR檢測孕婦血清中HCMVDNA,產(chǎn)前診斷巨細(xì)胞病毒感染可靠,有一定的臨床應(yīng)用價值,17例HCMV-DNA拷貝數(shù)大于1.0×107copies/m l且發(fā)生母嬰垂直傳播,這說明孕婦體內(nèi)的HCMV-DNA拷貝數(shù)的高低與是否發(fā)生垂直感染有一定的關(guān)系。61例HCMV-DNA陽性的HCMV-IgM陰性的孕婦9例發(fā)生了HCMV的宮內(nèi)傳播提示部分感染孕婦未能檢出HCMV-IgM,但不能排除宮內(nèi)傳播,而熒光定量PCR檢測HCMV-DNA能早期診斷孕婦宮內(nèi)感染,預(yù)測胎兒感染情況。診斷HCMV感染的新生兒有54例HCMV-DNA陽性,,提示這寫新生兒不但感染了HCMV,而且體內(nèi)有HCMV的復(fù)制,孕婦感染后通過胎盤垂直傳播殼引起先天性感染。圍產(chǎn)期新生兒經(jīng)產(chǎn)道或母乳及密切接觸感染為后天獲得性感染,年齡愈小,易感性愈高,癥狀也愈重。HCMV為細(xì)胞內(nèi)感染,很難被宿主完全清楚,而且HCMV有不同的病毒株,抗體不能保護(hù)患兒免受其他病毒株的感染。

綜上所述,熒光定量PCR檢測可以準(zhǔn)確的反映出患者體內(nèi)HCMV感染及其病毒復(fù)制情況,通過病毒復(fù)制判斷感染的嚴(yán)重程度,指導(dǎo)臨床用藥和療效觀察,是目前臨床最好的推薦方法之一。

[1]Grefte JM,Vander Gun BT,Schmolke S,et al.The lowermatrix protein pp65 is the principal viral antigen preset in peripheral blood leukocytes during an active cytomegalovirus infection[J].Gen Virol,1992,73（3）:2923.

[2]牛艾茹,陳培佳.定量DNA和IgM抗體檢測CMV感染[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志,2002,10（4）:40.

[3]Gourlain K,Salmon D,Gault E et al.Quantitation of cytomegalovirus（CMV）DNA by real-timePCR for occurrence ofCMV diseasein HIV-infected patients receiving highly active antiretroviral therapy[J].JM iolDiagn,2003,5（1）:15.

[4]Kearna AM,Turner AJL,Eltringham GJAet al.Rapid detection and quantification of CMV DNA in urine using LightCycler-Based FQ-PCR[J].J Clin Virol,2002,24:131.