鄭 鵬，李冬旭，田亞光，黃 賀，張貴學(xué)

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030）

自1994年Brinter和Eimmerman報(bào)道將可育小鼠的精原干細(xì)胞移植到不育小鼠的睪丸中并建立了精子以來(lái)，精原干細(xì)胞成為干細(xì)胞研究領(lǐng)域的又一個(gè)研究熱點(diǎn)[1]。精原干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，將會(huì)為克隆動(dòng)物、瀕危動(dòng)物保種、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)、治療雄性不育及一些人類(lèi)遺傳疾病的基因治療提供新的機(jī)遇與途徑。一些實(shí)驗(yàn)室分別對(duì)新生鼠[2]、幼鼠[3－4]、成年鼠[5]、成年人[6]、幼年山羊[7]、新生豬與幼年豬[8－9]、3～7月齡牛[10]的精原干細(xì)胞進(jìn)行了分離純化、體外培養(yǎng)、移植等相關(guān)研究，而對(duì)新生牛精原干細(xì)胞的研究報(bào)道很少。為此，本研究以新生牛作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，對(duì)睪丸生精上皮細(xì)胞進(jìn)行分離純化與冷凍保存，以期為牛精原干細(xì)胞的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與藥品

新生牛睪丸（2 h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室）；試驗(yàn)試劑除DMEM/F－12、FBS購(gòu)自Gibco公司外，其他無(wú)特殊說(shuō)明外均購(gòu)自Sigma公司；試驗(yàn)所用抗體無(wú)特殊說(shuō)明外均購(gòu)自Santa cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 睪丸組織學(xué)觀察

取睪丸組織小塊，放入pH 7.2的2.5%戊二醛固定液中固定，進(jìn)行電鏡切片的制作和觀察。

1.2.2 新生牛睪丸生精上皮細(xì)胞懸液的制備

將睪丸組織在PBS中撥散，獲得曲精細(xì)管小段。用含有 0.15%膠原酶Ⅳ及 10 μg·mL－1DNaseⅠ的消化液在室溫條件下消化5～10 min，期間吹打2～3 次，600 r·min－1離心 5 min 去除消化液，重復(fù)上述消化1次。然后用0.25%胰酶室溫消化，期間不斷吹打，待懸液中看不到曲細(xì)精管時(shí)加入等量的基礎(chǔ)培養(yǎng)液（DMEM/F－12+10%FBS+1%雙抗）終止消化，100 μm濾網(wǎng)過(guò)濾，將過(guò)濾后的細(xì)胞懸液以1 000 r·min－1離心10 min去除上清液，將細(xì)胞沉淀重新以基礎(chǔ)培養(yǎng)液懸起并制作細(xì)胞涂片，進(jìn)行AKP染色（北京中杉金橋）。

1.2.3 差速貼壁分選細(xì)胞

將生精上皮細(xì)胞懸液以（1～5）×106個(gè)·mL－1接種到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)2～4 h，用吸管輕輕吹打，懸起尚未緊密貼壁的生精細(xì)胞和部分支持細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)過(guò)夜，然后用吸管吹打懸起生精細(xì)胞，細(xì)胞懸液經(jīng)1 000 r·min－1離心5 min，棄上清，用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。分選前后，進(jìn)行AKP染色鑒定分離純化效果。

將差速貼壁分選后的細(xì)胞制作細(xì)胞涂片。進(jìn)行兔抗人 C－kit抗體（1∶300，北京中杉金橋）、羊抗OCT－4多克隆抗體（1∶500）免疫組化染色。

1.2.4 精原干細(xì)胞的冷凍保存

將曲細(xì)精管剪成小段，按照階段降溫法（4℃，1 h；－20℃，1 h；－80℃過(guò)夜）進(jìn)行冷凍保存。冷凍液分別是基礎(chǔ)培養(yǎng)液加上含量為5%、10%、15%的二甲基亞砜、乙二醇、甘油。復(fù)蘇后，消化成單細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力。

1.2.5 支持細(xì)胞的分離純化與鑒定

按照精原干細(xì)胞分離純化的步驟，培養(yǎng)2～4 h后，用吸管輕輕吹打，更換新鮮基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)過(guò)夜，用胰酶消化后重新接種，培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行HE染色、油紅O染色、波形蛋白（Vimentin）免疫組化染色。

1.2.6 支持細(xì)胞的冷凍保存

選取狀態(tài)良好的第三代支持細(xì)胞按照階段降溫法進(jìn)行冷凍保存。冷凍液分別是基礎(chǔ)培養(yǎng)液加上含量為10%的二甲基亞砜、乙二醇，然后在兩種基本冷凍液中分別添加 0.1 mmol·L－1、0.2 mmol·L－1的蔗糖、海藻糖。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05為差異具有顯著性意義，數(shù)據(jù)表示為±S。

2 結(jié)果與分析

2.1 組織學(xué)觀察

新生牛睪丸的曲細(xì)精管由附于基膜外的肌樣細(xì)胞、基膜、基膜所包圍的支持細(xì)胞和精原干細(xì)胞組成。支持細(xì)胞緊貼基膜（見(jiàn)圖1），形態(tài)多樣，有圓形、錐形和柱狀，細(xì)胞直徑約15 μm，胞質(zhì)著色較深，細(xì)胞核的形狀隨細(xì)胞形狀的不同而各異，1～3個(gè)核仁，位置不固定，在核質(zhì)中和核內(nèi)膜都有分布。精原干細(xì)胞根據(jù)直徑可分為兩種類(lèi)型，一種是直徑約15～20 μm的大精原細(xì)胞，另一種是直徑約10～15 μm的小精原細(xì)胞，精原干細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)染色較淺，細(xì)胞核較大，圓形，1～2個(gè)核仁。精原干細(xì)胞有的附在基膜上（見(jiàn)圖1A），有的位于管腔中央（見(jiàn)圖1B）。在曲細(xì)精管之間是睪丸間質(zhì)細(xì)胞和毛細(xì)血管。

圖1 睪丸曲細(xì)精管橫切Fig.1 Cross sections of seminiferous tubules

2.2 精原干細(xì)胞的分離純化與鑒定

睪丸組織經(jīng)過(guò)第一次消化和低速離心洗滌，已基本除去了睪丸間質(zhì)細(xì)胞，所獲得的睪丸組織樣品主要是曲細(xì)精管；再經(jīng)過(guò)消化、過(guò)濾和離心洗滌后，既除去了未消化完全的組織塊，也進(jìn)一步除去了睪丸間質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞碎片，所獲睪丸細(xì)胞懸液中主要有精原干細(xì)胞和支持細(xì)胞。AKP染色顯示，有少量的細(xì)胞是陽(yáng)性的，初步判斷是精原干細(xì)胞（見(jiàn)圖2A）。

差速貼壁分選前后，通過(guò)AKP染色進(jìn)行驗(yàn)證分析，結(jié)果顯示分選前培養(yǎng)物中只有極少數(shù)細(xì)胞是陽(yáng)性的，分選后培養(yǎng)物中大多數(shù)細(xì)胞是陽(yáng)性的，細(xì)胞陽(yáng)性率為72%（見(jiàn)表1）。對(duì)分選后的精原干細(xì)胞進(jìn)行免疫組化分析，結(jié)果C－kit（見(jiàn)圖2B）、OCT－4（見(jiàn)圖2C）均呈陽(yáng)性。

2.3 精原干細(xì)胞的冷凍保存

由表2可知，三種冷凍液中，以二甲基亞砜為冷凍劑的效果最好，二甲基亞砜的適合添加濃度為10%。

圖2 精原干細(xì)胞鑒定Fig.2 Identification of spermatogonial stem cells

表1 精原干細(xì)胞的差速貼壁分選（n=10）Table 1 Differential adherent spermatogonial stem cells selection（n=10）(%)

表2 精原干細(xì)胞在三種冷凍液中的細(xì)胞復(fù)蘇率（n=10）Table 2 Spermatogonia stem cell survival rate with three cryoprotectants（n=10）(%)

2.4 支持細(xì)胞分離純化與鑒定

生精細(xì)胞懸液培養(yǎng)2～4 h后，更換新鮮培養(yǎng)液后觀察，可見(jiàn)貼壁細(xì)胞已經(jīng)極化、胞體伸展、形態(tài)不規(guī)則，初步判定是支持細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)夜。HE染色：支持細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，胞質(zhì)完全鋪開(kāi)，染色較淡，而細(xì)胞核染色較深，呈圓形或橢圓形位于細(xì)胞質(zhì)中央或偏位，核仁明顯（見(jiàn)圖3A）。油紅O染色可使支持細(xì)胞核周?chē)植嫉脑S多圓形或卵圓形的脂質(zhì)小滴呈紅色或紅褐色，而細(xì)胞其他部分不著色（見(jiàn)圖3B）。在睪丸曲細(xì)精管中，波形蛋白特異地表達(dá)于支持細(xì)胞，免疫組化染色顯示培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)波形蛋白（見(jiàn)圖3C）。

圖3 支持細(xì)胞染色Fig.3 Sertoli cells staining

2.5 支持細(xì)胞冷凍保存

由表3可以看出：添加海藻糖能顯著提高冷凍效果，10%乙二醇和0.1 mmol·L-1海藻糖組合是最佳的冷凍保護(hù)劑。

表3 支持細(xì)胞在不同冷凍保護(hù)劑中的復(fù)蘇率（n=5）Table 3 Sertoli cells survival rate with some cryoprotectants（n=5）

3 討論與結(jié)論

3.1 組織學(xué)觀察

原始生殖細(xì)胞遷移到生殖嵴并轉(zhuǎn)化為性原細(xì)胞，性原細(xì)胞進(jìn)行短時(shí)間的有絲分裂增殖，然后停止在G0/G1期，小鼠出生后不久，性原細(xì)胞恢復(fù)分裂活動(dòng)并向基膜遷移，第6天左右到達(dá)基膜轉(zhuǎn)化為精原干細(xì)胞，即As型精原細(xì)胞[11]。試驗(yàn)中觀察到性原細(xì)胞已向基膜遷移，性原細(xì)胞何時(shí)恢復(fù)分裂活動(dòng)、何時(shí)到達(dá)基膜，目前還不是很清楚，Wrobel等認(rèn)為至少需要25周的時(shí)間[12]。大精原細(xì)胞和小精原細(xì)胞是否具有不同的發(fā)育命運(yùn)，有待于進(jìn)一步的研究，Wrobel等認(rèn)為小精原細(xì)胞與大精原細(xì)胞相比很少分化[12]。Izadyar等證實(shí)幾乎全部的大精原細(xì)胞都表現(xiàn)出C-kit陽(yáng)性，而很少有小精原細(xì)胞表現(xiàn)出C-kit陽(yáng)性[10]。

3.2 精原干細(xì)胞與支持細(xì)胞的分離純化

生精細(xì)胞懸液中常常并不能完全徹底地分離出目的細(xì)胞，只能達(dá)到培養(yǎng)物中以某種細(xì)胞為主的程度，所以也常稱(chēng)為富集（Enrichment）。分離純化的方法主要有：不連續(xù)Percoll密度梯度離心法[8-10]、差速貼壁分選法[2]、盤(pán)化法[7]、流式細(xì)胞分選法[2,4,11]以及免疫磁珠分離法[4,6]等。本試驗(yàn)通過(guò)酶消化法結(jié)合差速貼壁分選法使精原干細(xì)胞的純度達(dá)到72%，可見(jiàn)，差速貼壁法分選法更簡(jiǎn)單、可行。

3.3 精原干細(xì)胞與支持細(xì)胞的冷凍

在冷凍過(guò)程中，海藻糖有助于穩(wěn)定細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)，具有良好的玻璃化形成能力[13]。乙二醇被認(rèn)為是高效低毒的滲透性保護(hù)劑，近年來(lái)廣泛應(yīng)用于哺乳動(dòng)物胚胎、人胚胎干細(xì)胞的冷凍中[14]，本試驗(yàn)主要探討了用低毒的乙二醇代替二甲基亞砜、添加蔗糖和海藻糖是否可行，試驗(yàn)證實(shí)，精原干細(xì)胞冷凍保存，以10%的二甲基亞砜為冷凍劑的效果最好；支持細(xì)胞冷凍保存，以10%乙二醇和0.1 mmol·L-1海藻糖組合作為冷凍保護(hù)劑的效果最好。

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