鄭 鵬，李冬旭，田亞光，黃 賀，張貴學(xué)

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030）

自1994年Brinter和Eimmerman報道將可育小鼠的精原干細胞移植到不育小鼠的睪丸中并建立了精子以來，精原干細胞成為干細胞研究領(lǐng)域的又一個研究熱點[1]。精原干細胞技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，將會為克隆動物、瀕危動物保種、轉(zhuǎn)基因動物的生產(chǎn)、治療雄性不育及一些人類遺傳疾病的基因治療提供新的機遇與途徑。一些實驗室分別對新生鼠[2]、幼鼠[3－4]、成年鼠[5]、成年人[6]、幼年山羊[7]、新生豬與幼年豬[8－9]、3～7月齡牛[10]的精原干細胞進行了分離純化、體外培養(yǎng)、移植等相關(guān)研究，而對新生牛精原干細胞的研究報道很少。為此，本研究以新生牛作為實驗動物，對睪丸生精上皮細胞進行分離純化與冷凍保存，以期為牛精原干細胞的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物與藥品

新生牛睪丸（2 h內(nèi)送回實驗室）；試驗試劑除DMEM/F－12、FBS購自Gibco公司外，其他無特殊說明外均購自Sigma公司；試驗所用抗體無特殊說明外均購自Santa cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 睪丸組織學(xué)觀察

取睪丸組織小塊，放入pH 7.2的2.5%戊二醛固定液中固定，進行電鏡切片的制作和觀察。

1.2.2 新生牛睪丸生精上皮細胞懸液的制備

將睪丸組織在PBS中撥散，獲得曲精細管小段。用含有 0.15%膠原酶Ⅳ及 10 μg·mL－1DNaseⅠ的消化液在室溫條件下消化5～10 min，期間吹打2～3 次，600 r·min－1離心 5 min 去除消化液，重復(fù)上述消化1次。然后用0.25%胰酶室溫消化，期間不斷吹打，待懸液中看不到曲細精管時加入等量的基礎(chǔ)培養(yǎng)液（DMEM/F－12+10%FBS+1%雙抗）終止消化，100 μm濾網(wǎng)過濾，將過濾后的細胞懸液以1 000 r·min－1離心10 min去除上清液，將細胞沉淀重新以基礎(chǔ)培養(yǎng)液懸起并制作細胞涂片，進行AKP染色（北京中杉金橋）。

1.2.3 差速貼壁分選細胞

將生精上皮細胞懸液以（1～5）×106個·mL－1接種到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)2～4 h，用吸管輕輕吹打，懸起尚未緊密貼壁的生精細胞和部分支持細胞，轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)過夜，然后用吸管吹打懸起生精細胞，細胞懸液經(jīng)1 000 r·min－1離心5 min，棄上清，用培養(yǎng)液重懸細胞。分選前后，進行AKP染色鑒定分離純化效果。

將差速貼壁分選后的細胞制作細胞涂片。進行兔抗人 C－kit抗體（1∶300，北京中杉金橋）、羊抗OCT－4多克隆抗體（1∶500）免疫組化染色。

1.2.4 精原干細胞的冷凍保存

將曲細精管剪成小段，按照階段降溫法（4℃，1 h；－20℃，1 h；－80℃過夜）進行冷凍保存。冷凍液分別是基礎(chǔ)培養(yǎng)液加上含量為5%、10%、15%的二甲基亞砜、乙二醇、甘油。復(fù)蘇后，消化成單細胞懸液，臺盼藍染色檢測細胞活力。

1.2.5 支持細胞的分離純化與鑒定

按照精原干細胞分離純化的步驟，培養(yǎng)2～4 h后，用吸管輕輕吹打，更換新鮮基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)過夜，用胰酶消化后重新接種，培養(yǎng)24 h后，進行HE染色、油紅O染色、波形蛋白（Vimentin）免疫組化染色。

1.2.6 支持細胞的冷凍保存

選取狀態(tài)良好的第三代支持細胞按照階段降溫法進行冷凍保存。冷凍液分別是基礎(chǔ)培養(yǎng)液加上含量為10%的二甲基亞砜、乙二醇，然后在兩種基本冷凍液中分別添加 0.1 mmol·L－1、0.2 mmol·L－1的蔗糖、海藻糖。

1.3 統(tǒng)計分析

用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，P＜0.05為差異具有顯著性意義，數(shù)據(jù)表示為±S。

2 結(jié)果與分析

2.1 組織學(xué)觀察

新生牛睪丸的曲細精管由附于基膜外的肌樣細胞、基膜、基膜所包圍的支持細胞和精原干細胞組成。支持細胞緊貼基膜（見圖1），形態(tài)多樣，有圓形、錐形和柱狀，細胞直徑約15 μm，胞質(zhì)著色較深，細胞核的形狀隨細胞形狀的不同而各異，1～3個核仁，位置不固定，在核質(zhì)中和核內(nèi)膜都有分布。精原干細胞根據(jù)直徑可分為兩種類型，一種是直徑約15～20 μm的大精原細胞，另一種是直徑約10～15 μm的小精原細胞，精原干細胞細胞質(zhì)染色較淺，細胞核較大，圓形，1～2個核仁。精原干細胞有的附在基膜上（見圖1A），有的位于管腔中央（見圖1B）。在曲細精管之間是睪丸間質(zhì)細胞和毛細血管。

圖1 睪丸曲細精管橫切Fig.1 Cross sections of seminiferous tubules

2.2 精原干細胞的分離純化與鑒定

睪丸組織經(jīng)過第一次消化和低速離心洗滌，已基本除去了睪丸間質(zhì)細胞，所獲得的睪丸組織樣品主要是曲細精管；再經(jīng)過消化、過濾和離心洗滌后，既除去了未消化完全的組織塊，也進一步除去了睪丸間質(zhì)細胞和細胞碎片，所獲睪丸細胞懸液中主要有精原干細胞和支持細胞。AKP染色顯示，有少量的細胞是陽性的，初步判斷是精原干細胞（見圖2A）。

差速貼壁分選前后，通過AKP染色進行驗證分析，結(jié)果顯示分選前培養(yǎng)物中只有極少數(shù)細胞是陽性的，分選后培養(yǎng)物中大多數(shù)細胞是陽性的，細胞陽性率為72%（見表1）。對分選后的精原干細胞進行免疫組化分析，結(jié)果C－kit（見圖2B）、OCT－4（見圖2C）均呈陽性。

2.3 精原干細胞的冷凍保存

由表2可知，三種冷凍液中，以二甲基亞砜為冷凍劑的效果最好，二甲基亞砜的適合添加濃度為10%。

圖2 精原干細胞鑒定Fig.2 Identification of spermatogonial stem cells

表1 精原干細胞的差速貼壁分選（n=10）Table 1 Differential adherent spermatogonial stem cells selection（n=10）(%)

表2 精原干細胞在三種冷凍液中的細胞復(fù)蘇率（n=10）Table 2 Spermatogonia stem cell survival rate with three cryoprotectants（n=10）(%)

2.4 支持細胞分離純化與鑒定

生精細胞懸液培養(yǎng)2～4 h后，更換新鮮培養(yǎng)液后觀察，可見貼壁細胞已經(jīng)極化、胞體伸展、形態(tài)不規(guī)則，初步判定是支持細胞。繼續(xù)培養(yǎng)過夜。HE染色：支持細胞形態(tài)不規(guī)則，胞質(zhì)完全鋪開，染色較淡，而細胞核染色較深，呈圓形或橢圓形位于細胞質(zhì)中央或偏位，核仁明顯（見圖3A）。油紅O染色可使支持細胞核周圍分布的許多圓形或卵圓形的脂質(zhì)小滴呈紅色或紅褐色，而細胞其他部分不著色（見圖3B）。在睪丸曲細精管中，波形蛋白特異地表達于支持細胞，免疫組化染色顯示培養(yǎng)的細胞表達波形蛋白（見圖3C）。

圖3 支持細胞染色Fig.3 Sertoli cells staining

2.5 支持細胞冷凍保存

由表3可以看出：添加海藻糖能顯著提高冷凍效果，10%乙二醇和0.1 mmol·L-1海藻糖組合是最佳的冷凍保護劑。

表3 支持細胞在不同冷凍保護劑中的復(fù)蘇率（n=5）Table 3 Sertoli cells survival rate with some cryoprotectants（n=5）

3 討論與結(jié)論

3.1 組織學(xué)觀察

原始生殖細胞遷移到生殖嵴并轉(zhuǎn)化為性原細胞，性原細胞進行短時間的有絲分裂增殖，然后停止在G0/G1期，小鼠出生后不久，性原細胞恢復(fù)分裂活動并向基膜遷移，第6天左右到達基膜轉(zhuǎn)化為精原干細胞，即As型精原細胞[11]。試驗中觀察到性原細胞已向基膜遷移，性原細胞何時恢復(fù)分裂活動、何時到達基膜，目前還不是很清楚，Wrobel等認為至少需要25周的時間[12]。大精原細胞和小精原細胞是否具有不同的發(fā)育命運，有待于進一步的研究，Wrobel等認為小精原細胞與大精原細胞相比很少分化[12]。Izadyar等證實幾乎全部的大精原細胞都表現(xiàn)出C-kit陽性，而很少有小精原細胞表現(xiàn)出C-kit陽性[10]。

3.2 精原干細胞與支持細胞的分離純化

生精細胞懸液中常常并不能完全徹底地分離出目的細胞，只能達到培養(yǎng)物中以某種細胞為主的程度，所以也常稱為富集（Enrichment）。分離純化的方法主要有：不連續(xù)Percoll密度梯度離心法[8-10]、差速貼壁分選法[2]、盤化法[7]、流式細胞分選法[2,4,11]以及免疫磁珠分離法[4,6]等。本試驗通過酶消化法結(jié)合差速貼壁分選法使精原干細胞的純度達到72%，可見，差速貼壁法分選法更簡單、可行。

3.3 精原干細胞與支持細胞的冷凍

在冷凍過程中，海藻糖有助于穩(wěn)定細胞膜和蛋白質(zhì)，具有良好的玻璃化形成能力[13]。乙二醇被認為是高效低毒的滲透性保護劑，近年來廣泛應(yīng)用于哺乳動物胚胎、人胚胎干細胞的冷凍中[14]，本試驗主要探討了用低毒的乙二醇代替二甲基亞砜、添加蔗糖和海藻糖是否可行，試驗證實，精原干細胞冷凍保存，以10%的二甲基亞砜為冷凍劑的效果最好；支持細胞冷凍保存，以10%乙二醇和0.1 mmol·L-1海藻糖組合作為冷凍保護劑的效果最好。

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