張 紅，馬 博

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，廣西南寧 530021；2.廣東公安邊防總隊(duì)醫(yī)院生殖中心，廣東深圳 518029）

上游法是較早用于分離精子的技術(shù)之一，由于其操作簡便也是現(xiàn)在多數(shù)生殖實(shí)驗(yàn)室使用的精子優(yōu)選方法[1]。上游法的原理就是活力高的精子可以從離心后的精液沉淀中游出至上層的培養(yǎng)液中[2]。隨著輔助生殖技術(shù)的不斷發(fā)展，優(yōu)選精子的上游法也有了其衍生方法。本研究主要比較兩種改良上游法對(duì)IVF的受精結(jié)果的影響。第一種上游法為：將精子洗滌液（美國 Quinn's）與精液1∶1充分混勻，若精液不液化，則反復(fù)吹吸使之液化，然后置于15 ml離心管中，用700×g離心力，離心5 min，離心后去上層液體，將精液沉淀吸出后緩慢置于裝有0.5 ml卵裂液HTF（美國 Quinn's）的5 ml試管底部，然后放置于5%二氧化碳，37℃溫箱中培養(yǎng)15～25 min后將上懸濁液吸出放于另一無菌的5 ml小試管，待用。此種上游法簡稱先離心法，其優(yōu)點(diǎn)是：操作簡單，節(jié)省試驗(yàn)耗材，能最大程度地回收精子。缺點(diǎn)是：離心后高密度的有缺陷的精子及白細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生高濃度的活性氧，進(jìn)而使正常精子受到損害[3]，而且在吸取上懸濁液時(shí)容易混入死精子及其他雜質(zhì)。第二種上游法：取3～4支10 ml圓底試管，每支試管加入1.5 ml精子洗滌液，將精子洗滌液與精液1∶1混勻并反復(fù)吹吸，然后將精液分為2～3等份，分別緩慢地加入圓底試管底部，然后將含精液試管傾斜45°，置于5%二氧化碳，37℃溫箱中培養(yǎng)30～45 min，培養(yǎng)后將各管上懸濁液吸入15 ml離心管中，以700×g離心力離心5 min，離心后棄去上清液，以0.3～0.4 ml卵裂液HTF與沉淀混勻，待用。此種上游法簡稱先上游法，優(yōu)點(diǎn)是：減少了異常精子及精漿中的其他雜質(zhì)對(duì)正常精子的損傷；缺點(diǎn)是：操作較復(fù)雜，對(duì)精子密度要求高。此兩種方法均較傳統(tǒng)的上游法[4]減少了離心次數(shù)，而離心可能對(duì)精子產(chǎn)生損傷[5]。

1 資料與方法

1.1 一般資料

對(duì)2009年2～9月因輸卵管因素不孕在廣東公安邊防總隊(duì)醫(yī)院生殖中心接受輔助生殖治療的患者進(jìn)行相關(guān)研究分析，為排除干擾因素我們選取夫婦雙方年齡均＜40歲，符合體外受精（in-vitro fertilization，IVF）指征，獲卵個(gè)數(shù)不少于6個(gè)，男方精液量不少于2 ml，共287周期進(jìn)入此項(xiàng)研究，女方年齡 25～37（29.5±3.5）歲，男方年齡 25～39（31.5±3.2）歲，不孕年限 4～13（8.0±3.1）年，男方精液檢查依照世界衛(wèi)生組織診斷標(biāo)準(zhǔn)，均為正常。

1.2 方法

1.2.1 臨床技術(shù) 所有周期均采用常規(guī)促排卵方案，前1個(gè)月經(jīng)周期第 21 天開始降調(diào)，達(dá)菲林（法國 Signes）0.8～1.5 mg 肌注，月經(jīng)周期第3天查性激素卵泡生成素、黃體生成素、雌二醇達(dá)到降調(diào)標(biāo)準(zhǔn)后用果納芬（瑞士 Sereno）或麗申寶（麗珠醫(yī)藥）促排卵，當(dāng)超聲檢查見1個(gè)直徑≥18 mm或2個(gè)直徑≥16 mm的卵泡時(shí)當(dāng)晚22∶00時(shí)給予HCG 8 000～10 000 IU肌注，34～36 h后經(jīng)陰道超聲引導(dǎo)下取卵。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)室技術(shù) 將取出的卵子分為數(shù)量約等的兩份，均放于5%二氧化碳，37℃溫箱中培養(yǎng)3～6 h，再將已經(jīng)調(diào)整為相似密度的兩種改良上游法優(yōu)選過的精子分別與兩組卵細(xì)胞共培養(yǎng)。16～18 h后觀察受精情況，并每隔24 h觀察胚胎分裂情況至移植當(dāng)天，以胚胎卵裂球數(shù)≥6，卵裂球大小均勻，碎片＜10%的胚胎為優(yōu)質(zhì)胚胎[6]。

1.2.3 觀察指標(biāo) 分別觀察兩組的正常受精率、卵裂率及優(yōu)質(zhì)胚胎率

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

將使用先離心法分離的精子行IVF產(chǎn)生的A組受精卵與使用先上游法分離的精子行IVF產(chǎn)生的B組受精卵進(jìn)行比對(duì)，A組有14個(gè)周期完全受精失敗，其中原發(fā)不孕9個(gè)周期，繼發(fā)不孕5個(gè)周期，有1 472個(gè)卵子行IVF，受精率為72.4%（1 066/1 472），卵裂率為 91.2%（972/1 066），優(yōu)質(zhì)胚胎率為52.5%（510/972）。B組中有12個(gè)周期完全受精失敗，其中原發(fā)不孕8個(gè)周期，繼發(fā)不孕4個(gè)周期，有1 493個(gè)卵子行IVF，受精率為 75.1%（1121/1493），卵裂率為 93.2%（1045/1 121），優(yōu)質(zhì)胚胎率為53.9%（563/1 045）。雖然B組中各項(xiàng)結(jié)果較A組好，但兩組中受精率、卵裂率、優(yōu)胚率的差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

胚胎的質(zhì)量是決定不孕患者能否通過輔助生殖技術(shù)（ART）成功受孕的主要因素之一，而精子和卵子的質(zhì)量又決定了胚胎的質(zhì)量。由于胞漿內(nèi)單精子注射技術(shù)（ICSI）的出現(xiàn)，臨床醫(yī)生過多地關(guān)注卵子的質(zhì)量，而忽略了精子在受精過程中的重要作用?，F(xiàn)在隨著男科學(xué)的不斷發(fā)展，精子對(duì)胚胎質(zhì)量的影響越來越多地被臨床醫(yī)生認(rèn)識(shí)和了解，如何更簡便地獲得優(yōu)質(zhì)的精子，也是生殖領(lǐng)域的研究人員在不斷探索的問題。在優(yōu)選精子的方法中上游法既操作簡單又能完全實(shí)現(xiàn)從精漿中分離活動(dòng)精子，提高活動(dòng)精子密度，使精子獲能等分離精子的目的，而由傳統(tǒng)的上游法衍生的改良上游法更是明顯地體現(xiàn)了上游法的優(yōu)點(diǎn)并為多數(shù)生殖實(shí)驗(yàn)室所使用。

本研究對(duì)使用兩種不同的上游法分離的精子進(jìn)行IVF操作，并對(duì)受精結(jié)果進(jìn)行分析。雖然B組的受精率、卵裂率、優(yōu)胚率等三項(xiàng)指標(biāo)均高于A組，但未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與文獻(xiàn)[3]報(bào)道有不同，究其原因可能為先離心法在離心及溫箱內(nèi)上游時(shí)間均短于相關(guān)文獻(xiàn)使用的時(shí)間，減少了正常精子與異常精子及精漿的接觸時(shí)間，或者是本研究的標(biāo)本數(shù)不足，沒有發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異。由于現(xiàn)在越來越多的證據(jù)顯示高濃度的死精子、未成熟精子、異常精子、精漿雜質(zhì)和白細(xì)胞會(huì)嚴(yán)重影響損傷正常精子[3，7]，并有學(xué)者認(rèn)為采用先離心再上游的方法獲得的精子行IVF有可能是導(dǎo)致完全不受精的原因[8]，并且IVF治療周期長，費(fèi)用高，因此在現(xiàn)有的條件下盡量減少對(duì)精子和卵子的損傷也是生殖實(shí)驗(yàn)室工作人員必須要注意的。

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