曾憲成，馬 璟

(上海醫(yī)藥工業(yè)研究院國家上海新藥安全評價研究中心，上海 201203)

目前，由于體外研究技術(shù)手段的局限性及藥品注冊相關(guān)法規(guī)的要求，動物整體實(shí)驗(yàn)在藥物研究與開發(fā)領(lǐng)域中仍發(fā)揮著不可替代的重要作用。藥物在人或動物體內(nèi)的動態(tài)過程是其藥效或毒性作用產(chǎn)生的前提。給藥時間不同，藥物吸收、分布、代謝及排泄 (absorbance，distribution，metabolism and excretion，ADME)等藥動學(xué)參數(shù)也將發(fā)生變化，即藥物體內(nèi)的動力學(xué)過程存在時間節(jié)律性。本文總結(jié)了國內(nèi)外動物生理節(jié)律影響體內(nèi)藥物作用過程及其機(jī)制等方面的研究進(jìn)展。

1 藥理或毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中動物生理節(jié)律現(xiàn)象

在藥理或毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中，最重要的就是確定劑量-效應(yīng)之間的關(guān)系，然而在實(shí)驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果分析時主要關(guān)注劑量設(shè)置及其對應(yīng)的藥效或毒性反應(yīng)，而常常忽略給藥時間對上述結(jié)果的影響。小鼠在不同時間點(diǎn) ip給予鎮(zhèn)痛藥曲馬朵(tranadol)后，于24:00(暗中期)給藥急性死亡率最高，于4:00(暗后期)給藥鎮(zhèn)痛作用較強(qiáng);另外，其體內(nèi)藥代動力學(xué)參數(shù)亦呈現(xiàn)出給藥時間依賴性［1］。大鼠分別于12:00(光照飼養(yǎng)期)及24:00(黑暗飼養(yǎng)期)給予氯唑沙宗(chlorzoxazone)后，前者血液消除半衰期(t1/2)顯著長于后者，但其經(jīng)細(xì)胞色素P450 CYP2E1(cytochrome P-450 CYP2E1，CYP2E1)酶的代謝產(chǎn)物6-羥基氯唑沙宗(6-hydroxychlorzoxazone)8 h血漿濃度-時間曲線下面積(the area under the curve from 0 to 8 h，AUC0～8h)卻明顯短于后者［2］。大鼠給藥時間不變，但當(dāng)取樣時間改變后，環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)誘導(dǎo)的小鼠骨髓微核率也具有時間節(jié)律性，在末次給藥后6 h達(dá)到最高［3］。

2 腸道藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的生理節(jié)律性表達(dá)及其調(diào)節(jié)機(jī)制

許多藥物發(fā)揮其療效主要取決于其跨越細(xì)胞屏障到達(dá)靶部位的能力，脂溶性藥物通過被動擴(kuò)散可以穿越腸道屏障而不需要特異的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，但親水性藥物需要特異的轉(zhuǎn)運(yùn)體系進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。因此，在多種口服藥物的動物體內(nèi)吸收過程中，腸道轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白發(fā)揮著重要作用。

2.1 腸道轉(zhuǎn)運(yùn)體的生理節(jié)律性表達(dá)

在腸道黏膜中有多種藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，包括介導(dǎo)藥物吸收的有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽(organic anion transporting polypeptide，OATP)、有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體(organic cation transporter，OCT)、肽轉(zhuǎn)運(yùn)體 1(peptide transporter 1，PEPT1)、單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(monocarboxylate transporter，MCT)和多藥耐藥相關(guān)蛋白 1(multidrug resistance-associated protein 1，MRP1)和MRP2，介導(dǎo)藥物外排的P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)和乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)。雄性SD大鼠空腸黏膜多藥耐藥蛋白1(multidrug-resistance protein 1，MDR1)，MCT1，MRP2，PEPT1及BCRP在轉(zhuǎn)錄水平呈現(xiàn)出時間節(jié)律性，MCT1及BCRP在光照期表達(dá)量最高，MRP2及PEPT1在黑暗期表達(dá)量最高［4］。PEPT1蛋白質(zhì)及mRNA水平在雄性Wistar大鼠十二指腸的表達(dá)呈現(xiàn)出生理節(jié)律性，其mRNA及蛋白質(zhì)的峰值表達(dá)均出現(xiàn)在20:00，谷值表達(dá)出現(xiàn)在 8:00［5］。 Na+-葡 萄 糖 共 轉(zhuǎn) 運(yùn) 體 1(sodium-glucose co-transporter 1，SGLT1)，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體2(glucose transporter 2，GLUT2)及GLUT5是嚙齒類動物小腸主要表達(dá)的幾種己糖(hexose)轉(zhuǎn)運(yùn)體。雄性C57BL/6小鼠十二指腸及空腸中SGLT1，GLUT2及GLUT5表達(dá)在蛋白質(zhì)及mRNA水平均呈現(xiàn)出時間節(jié)律性;十二指腸中mRNA在15:00表達(dá)量達(dá)峰值，而蛋白質(zhì)表達(dá)量在9:00達(dá)峰值;空腸中SGLT1 mRNA表達(dá)量在21:00達(dá)峰值，GLUT2和GLUT5 mRNA在15:00達(dá)峰值，三種蛋白質(zhì)表達(dá)的峰值水平均出現(xiàn)在3:00，其中GLUT2可以維持到9:00;而回腸中三者僅在mRNA水平被觀察到有時間節(jié)律性，它們的峰值表達(dá)量出現(xiàn)在21:00［6］。雄性大鼠十二指腸中SGLT1的mRNA及蛋白質(zhì)峰值表達(dá)量均出現(xiàn)在20:00，而峰谷表達(dá)量出現(xiàn)在8:00［5］;空腸中其 mRNA表達(dá)量在16:00達(dá)峰值，蛋白質(zhì)的峰值表達(dá)則出現(xiàn)于22:00;但在回腸中僅mRNA水平表現(xiàn)出時間節(jié)律性，它在22:00表達(dá)量達(dá)峰值［7］。闡明上述葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體的時間節(jié)律性規(guī)律及其調(diào)節(jié)機(jī)制不僅有助于推動多種疾病如糖尿病、肥胖性疾病和吸收紊亂等的治療，另外也將推動對上述轉(zhuǎn)運(yùn)體參與的藥物動力學(xué)時間節(jié)律性的認(rèn)識，因?yàn)殚纹に?4'-β-葡糖苷(quercetin-4'-β-glucoside)和槲皮素-3-葡糖苷(quercetin-3-glucoside)已被證實(shí)是 SGLT1 的典型底物［8－9］。

2.2 腸道轉(zhuǎn)運(yùn)體生理節(jié)律性表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制

下丘腦視交叉上核(suprachiasmatic nucleus，SCN)及外周組織如肝臟、心臟、脂肪組織及小腸等的生物鐘共同構(gòu)成了機(jī)體節(jié)律計時系統(tǒng)(circadian timing system)，且兩者在組成成分及調(diào)節(jié)機(jī)制方面基本相同，主要由一系列相互聯(lián)系的反饋回路(feedback loop)組成;時鐘蛋白(clock protein)及腦和肌肉組織芳香羥受體核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的類似蛋白1(brain and muscle ARNT-like 1，BMAL1)組成了正向調(diào)節(jié)支路(positive limb)，周期時鐘蛋白(period clock protein，PER)1、PER2、藍(lán)光受體隱花色素 (cryptochrome，CRY)1及CRY2組成了負(fù)向調(diào)節(jié)支路(negative limb);孤兒核受體Rev-erbα組成了另一條反饋調(diào)節(jié)支路;富含脯氨酸和酸性氨基酸堿性亮氨酸拉鏈(proline and acidic amino acid-rich basic leucine zipper，PARbZip)的轉(zhuǎn)錄因子白蛋白基因D位點(diǎn)結(jié)合蛋白(albumin gene D-site binding protein，DBP)、肝性白血病因子(hepatic leukemia factor，HLF)及促甲狀腺素胚胎因子(thyrotroph embryonic factor，TEF)共同組成了用于介導(dǎo)機(jī)體生物鐘下游反應(yīng)的輸出性調(diào)節(jié)子(output regulators)［10－12］。其中，DBP蛋白在調(diào)節(jié)生理節(jié)律性反應(yīng)時發(fā)揮著十分重要的作用。一方面DBP蛋白通過與PER1啟動子區(qū)結(jié)合而與時鐘蛋白及BMAL1形成的復(fù)合物共同誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄，另一方面DBP轉(zhuǎn)錄分別受到時鐘蛋白-BMAL1復(fù)合物誘導(dǎo)及PER和CRY蛋白抑制調(diào)控［13］。DBP在小腸的時間節(jié)律表達(dá)時相與PEPT1蛋白一致，并且通過與PEPT1啟動子區(qū)結(jié)合而誘導(dǎo)PEPT1轉(zhuǎn)錄［14］。因此DBP在PEPT1生理節(jié)律性表達(dá)中發(fā)揮著重要作用。迷走神經(jīng)在機(jī)體許多內(nèi)部器官功能調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著重要作用，同時它也參與了腸道葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體時間節(jié)律性調(diào)節(jié)。大鼠腹部迷走神經(jīng)被切除后，空腸 SGLT1、GLUT5及GLUT2 mRNA的表達(dá)仍具有生理節(jié)律性，但 SGLT1及GLUT2蛋白質(zhì)水平的時間節(jié)律性表達(dá)未曾見到，迷走神經(jīng)似乎通過mRNA轉(zhuǎn)錄后或翻譯后加工參與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體生理節(jié)律性調(diào)節(jié)［15］。但是，迷走神經(jīng)不參與SGLT1蛋白質(zhì)水平的時間節(jié)律性表達(dá)目前尚存在爭議［16］。堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子腺病毒E4啟動子結(jié)合蛋白4(adenovirus E4 promoter ATF site binding protein 4，E4BP4)及HLF通過競爭結(jié)合相同DNA位點(diǎn)而對小腸MDR1a基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生不同方向的調(diào)節(jié)作用;E4BP4含量在體內(nèi)周期性波動，僅在含量高時抑制MDR1a轉(zhuǎn)錄，HLF對MDR1a的轉(zhuǎn)錄具有活化作用［17］。

3 肝臟藥物代謝酶的生理節(jié)律性表達(dá)及其調(diào)節(jié)機(jī)制

肝臟是迄今已知最重要的藥物代謝器官。藥物代謝酶在外源性或內(nèi)源性化合物代謝或解毒過程中發(fā)揮著重要作用。根據(jù)它們參與的藥物代謝反應(yīng)時相，可分為Ⅰ相酶和Ⅱ相酶，Ⅰ相酶主要有肝微粒體中CYP450;Ⅱ相酶主要有尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UDP-glucuronosyltransferases，UGT)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶 (glutathione S-transferases，GST)、磺基轉(zhuǎn)移酶(sulfotransferases，SULT)和N-乙?；D(zhuǎn)移酶(N-acetyltransferases，NAT)等。另外肝臟還分布有參與藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的多種轉(zhuǎn)運(yùn)體，包括P-gp、MRP、BCRP及MDR等。

3.1 肝臟藥物代謝酶的生理節(jié)律性表達(dá)

早期對肝臟藥物代謝酶生理節(jié)律性的研究主要通過監(jiān)測酶活性及相應(yīng)代謝產(chǎn)物含量。小鼠GST活性光照期(7:00－19:00)高于黑暗期(19:00－7:00)，且具有底物特異性，24 h 內(nèi)分別作用 1-氯-2，4-二硝基苯(1-chloro-2，4-dinitrobenzene，CDNB)與 1，2-環(huán)氧-3-(對硝基苯氧基)丙烷［1，2-epoxy-3-(p-nitrophenoxy)propane，EPNP］2 種底物，相應(yīng)酶活性的峰谷值出現(xiàn)的時相是相反的，酶與CDNB反應(yīng)的峰值出現(xiàn)在13:00，谷值在1:00［18］?；蛐酒夹g(shù)可以同時觀察影響機(jī)體的許多重要生理功能基因的生理節(jié)律性表達(dá)。在Fisher 344雄性大鼠3906個基因中，1171(30%)個基因可被清晰的觀察到具有時間節(jié)律性，其中1029個(88%)基因峰值表達(dá)增加倍數(shù)小于1.5，在67個顯著性表達(dá)增加的基因中包含CYP4A3的基因及推定的乙?；D(zhuǎn)移酶camello 4(putative N-acetyltransferase camello 4，Clm4)的基因，肝CYP4A酶異構(gòu)體主要通過催化生成20-羥二十烷四烯酸(20-hydroxyeicosatetraenoic acids)而調(diào)節(jié)腎動脈和腎小管離子轉(zhuǎn)運(yùn)，Clm4在芳香胺及聯(lián)氨乙?；磻?yīng)中發(fā)揮著重要作用［19］。在CD-1雄性小鼠肝臟2122個基因中，187(8.8%)個基因的表達(dá)呈現(xiàn)出明顯的時間節(jié)律性，其中與藥物代謝有關(guān)的有GSTθ2，CYP17，CYP2A4及 CYP2E1，四者 mRNA 表達(dá)均在夜間達(dá)到最高［20］。另外CYP2C22、羧酸酯酶基因及gst基因在小鼠肝臟中亦呈節(jié)律性表達(dá)，GST的cDNA峰值表達(dá)出現(xiàn)在8:00，CYP2C22及羧酸酯酶的cDNA峰值表達(dá)則出現(xiàn)在20:00［21］。小鼠肝臟Ⅰ相藥物代謝酶的mRNA通常在黑暗期表達(dá)增加;CYP2B10的峰值表達(dá)出現(xiàn)在2:00，而峰谷表達(dá)則出現(xiàn)在2:00;CYP2E1及CYP3A11的峰值表達(dá)則分別出現(xiàn)在22:00和2:00;CYP1A2的峰值表達(dá)出現(xiàn)在6:00;CYP4A14的節(jié)律性表達(dá)略顯復(fù)雜一點(diǎn)，它在光照期會維持在一個較為穩(wěn)定的水平，在18:00表達(dá)量達(dá)峰值，至黑暗中期(22:00－2:00)下降至峰谷水平，在光照期又恢復(fù)至較高水平［22］。Ⅱ相酶 mRNA的表達(dá)多數(shù)在光照期達(dá)到峰值;UGTLA家族的UGT1A1，UGT1A6及UGT1A9和UGT2家族的UGT2A3，UGT2B35及UGT2B36峰值表達(dá)量均出現(xiàn)在14:00，而UGT1A5在2:00表達(dá)量最高，UGT2B34在6:00表達(dá)量最高;SULT1A1，SULT1D1及SULT5A1的峰值表達(dá)出現(xiàn)在光暗過渡期;GSTA1，GSTA2，GSTA4，GSTM1，GSTM2，GSTM3，GSTM4及GSTM6的最高表達(dá)均出現(xiàn)在光照早期10:00，最低表達(dá)則出現(xiàn)在黑暗中期22:00，GSTT1在光暗過渡期6:00和18:00表達(dá)量會升高，而GSTT2在黑暗期會增加表達(dá)［22］。BCRP，MRP2及MDR2在24 h內(nèi)的表達(dá)波動幅度小于2倍，但MDR1的波動幅度卻超過2.9倍，且在22:00出現(xiàn)峰值表達(dá)［22］。上述研究結(jié)果表明，參與動物體內(nèi)藥物處置過程的肝臟藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體及其亞型mRNA的表達(dá)多數(shù)具有生理節(jié)律性，而且峰谷值出現(xiàn)時相不一。在使用藥物時應(yīng)該首先弄清楚參與該藥體內(nèi)處置過程的肝臟藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體的種類，然后結(jié)合這些酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)及功能的生理節(jié)律性設(shè)計出合理的給藥和取樣時間，以獲取最大藥效或者更多不良反應(yīng)等信息。

3.2 肝臟藥物代謝酶生理節(jié)律性表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制

肝臟藥物代謝酶生理節(jié)律性表達(dá)受到肝臟自身時鐘基因的調(diào)節(jié)。在Wistar大鼠肝臟中，PER2、BMAL1、DBP、核受體超家族成員1d1(nuclear receptor subfamily 1 group D member 1，Nr1d1)及Nr1d2 5種時鐘基因的表達(dá)呈現(xiàn)出明顯的生理節(jié)律性［23］。當(dāng)小鼠肝臟BDP，TEF及HLF三種基因同時被敲除后，組成型雄烷受體(constitutive androstane receptor，CAR)調(diào)節(jié)的CYP450酶CYP4A和CYP2C，CAR調(diào)節(jié)的多種藥物代謝酶，包括CYP2B及CYP3A等Ⅰ相酶，GST及UGT等Ⅱ相酶，ATP結(jié)合盒蛋白(ATP binding cassette，ABC)G2、ABCC4(MRP4)、ABCA8A、ABCA6 及 ABCB1B 等藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體，氨基乙酰丙酸合酶1(aminolevulinic acid synthase 1，ALAS1)和CYP450氧化還原酶的基因表達(dá)均發(fā)生變化［24］。

4 腎臟藥物排泄功能的生理節(jié)律性變化及調(diào)節(jié)

腎臟在藥物、有毒物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的清除過程中也發(fā)揮了重要作用，主要通過腎小球?yàn)V過、腎小管分泌及腎小管重吸收等途徑完成對上述物質(zhì)的清除。大鼠尿蛋白含量、腎小球?yàn)V過率及腎血漿流量在夜間活動期均高于休息期［25］，另外，動物尿液pH值也可呈現(xiàn)出生理節(jié)律性變化［26］。上述腎臟生理功能的節(jié)律性變化均可影響它對藥物的清除過程。腎臟存在時鐘基因 rPER1、rPER2、rPER3、BMAL1及 DBP，并且呈現(xiàn)時間節(jié)律性表達(dá)，它們在20:00的表達(dá)量均高于8:00［27］。Na+/H+交換體3在維持機(jī)體電解質(zhì)及酸堿平衡過程中具有重要作用，其mRNA表達(dá)呈現(xiàn)節(jié)律性變化并且時鐘蛋白/BMAL1異二聚體調(diào)控［28］。Na+對維持胞外液體積及血壓發(fā)揮著關(guān)鍵作用，在醛固酮調(diào)節(jié)下，通過表皮Na+通道從腎小管液被吸收至胞外，表皮Na+通道的mRNA表達(dá)具有明顯的時間節(jié)律性，PER1參與了上述過程的調(diào)節(jié)［29］。

5 展望

在腸道、肝臟及腎臟等重要生命器官中，與藥物代謝過程密切相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)體及代謝酶的功能發(fā)揮具有不同程度的時間依賴性。因此，在考察藥物療效及其毒性研究中，除關(guān)注劑量-效應(yīng)關(guān)系外，還應(yīng)考慮給藥時間-效應(yīng)關(guān)系。嚴(yán)格控制動物光照時間及程序，合理設(shè)計及精確控制動物給藥及采樣時間點(diǎn)對遵守動物生理節(jié)律規(guī)律并消除其對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響具有重要的保障作用。目前，多數(shù)研究是從mRNA水平，依靠基因芯片技術(shù)對上述藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體、代謝酶功能的時間依賴性規(guī)律進(jìn)行了研究?；蛐酒夹g(shù)可以呈現(xiàn)出不同時間條件下組織或者細(xì)胞的基因表達(dá)譜，可以很方便的篩檢出感興趣基因。但是，藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體、藥物代謝酶及相關(guān)調(diào)節(jié)因子大部分是以蛋白質(zhì)形態(tài)發(fā)揮功能，基因轉(zhuǎn)錄后及翻譯后的調(diào)控使得mRNA與蛋白質(zhì)表達(dá)水平并不能始終一致。因此，應(yīng)該從蛋白質(zhì)水平考察它們的時間節(jié)律性及其調(diào)節(jié)機(jī)制，引入蛋白質(zhì)組學(xué)理論和技術(shù)，將會加快本領(lǐng)域的研究進(jìn)程。肝臟自身生物鐘相關(guān)基因已被證實(shí)參與了藥物代謝酶時間節(jié)律性表達(dá)的調(diào)節(jié)，并且肝臟生物鐘調(diào)節(jié)需要SCN參與［30］，但SCN是否參與肝臟藥物代謝酶調(diào)節(jié)及其機(jī)制需要進(jìn)一步研究。腎臟分布有大量的轉(zhuǎn)運(yùn)體，與藥物代謝有關(guān)的包括ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體及溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體家族，這些轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)是否具有生理節(jié)律性及其調(diào)節(jié)機(jī)制也需要進(jìn)一步研究。

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