王 宏,薛 原,2,張秀英

(1.東北農業(yè)大學動物醫(yī)學學院,黑龍江 哈爾濱 150030;2.東北林業(yè)大學野生動物資源學院,黑龍江 哈爾濱 150040)

隨著抗生素在臨床上的廣泛應用,細菌在抗生素的選擇壓力下耐藥菌株不斷產(chǎn)生,耐藥性問題日益嚴重,其中整合子是加快臨床耐藥菌株產(chǎn)生的重要原因。它是細菌基因組中可移動的遺傳物質,通過位點特異性重組捕獲外源基因盒(gene cassettes)并使之表達,同時整合子可位于質粒、染色體或自身作為轉座子的一個組成部分而參與轉移,使細菌的耐藥性在病原菌中廣泛傳播。

1 整合子

1.1 整合子的結構 自整合子-基因盒系統(tǒng)正式提出以來,該系統(tǒng)目前對耐藥機制研究起了很大的作用,并已取得了較大的進展[1]。

整合子基本結構包括 5′保守末端(5′-CS)、3′保守末端(3′-CS)和兩者之間的可變區(qū)三部分。5′-CS是整合子的基本結構,包括編碼整合酶的基因(Int I)、整合子重組位點att I和整合子可變區(qū)啟動子(Pant)。Int I屬于酪氨酸整合酶家族,催化基因盒在整合子重位點att I和基因盒重組位點attC之間的整合和剪切[2]。有的整合子在Pant下游還有啟動子P2?？勺儏^(qū)可插入編碼一些功能的基因為抗生素耐藥基因,被稱為基因盒。有的整合子在5′-CS和3′-CS之間沒有基因盒插入,插入的基因盒不能自身進行表達,必須借助于5′端的2個啟動子。整合子的3′端的結構因不同菌株和整合子類型不同而異,有的甚至沒有3′端結構。

1.2 整合子的分類 整合酶基因(Int I)可以捕捉外來游離基因盒將其整合在整合子上,同時也可以將自身的基因盒切除,形成自由環(huán)狀片段[3]。目前根據(jù)整合酶的序列不同,至少已發(fā)現(xiàn)有10種整合子,其中6類整合子含有抗生素耐藥基因盒[4-5],但公開報道研究最多的整合子主要有4種。

Ⅰ類整合子最常見,其5′-CS末端區(qū)有編碼整合酶的基因Int I及啟動子Pant,部分還會有啟動子P 2[6],3′-CS末端包括3個開放閱讀框(ORF),即磺胺耐藥基因(SulⅠ),季銨鹽化合物及溴化乙淀耐藥基因(qacE△1)及功能不明的ORF-5[7]。兩個片段之間區(qū)域可插入有編碼功能的基因盒。大多數(shù)Ⅰ類整合子的 5′-CS相似 3′-CS存在差異,通常存在于Tn21及與Tn21類似的轉座子上。此整合子陽性株的耐藥率明顯高于整合子陰性株[8]。

Ⅱ類整合子存在于 Tn7或它的衍生物上,與IntI1有40%的同源性,其整合酶基因IntI2是缺陷的整合酶基因,不能催化基因盒的整合與剪切。目前僅發(fā)現(xiàn)核苷轉移酶基因aadA la、甲氧芐啶耐藥基因dfr及鏈霉素耐藥基因sat位于該類整合子上。

Ⅲ類在耐碳青霉烯類抗生素的粘質沙雷菌的質粒上發(fā)現(xiàn)的,其整合酶IntI3與IntI1有60.9%的同源性。Ⅲ類整合子攜帶編碼β-內酰胺酶的基因盒,且目前只發(fā)現(xiàn)耐碳青霉烯類抗生素基因位于該整合子,可能是轉座子的一部分,與Tn402密切相關。

Ⅳ類整合子是在霍亂弧菌基因組中首次發(fā)現(xiàn),其整合酶IntI4與前三類整合子的整合酶有45%～50%的同源性。此類整合子的可變區(qū)可帶有上百個基因盒,故又稱為超級整合子(SI)。SI基因盒中的基因除了與細菌耐藥有關外,還與細菌的代謝和毒力有關。此外在梅氏弧菌、費氏弧菌、擬態(tài)弧菌等細菌的染色體基因組中也發(fā)現(xiàn)了超級整合子。

Ⅴ類整合子見于最小弧菌。Ⅵ類整合子見于麥氏弧菌,含有26個獨立基因盒[9]。

2 基因盒

2.1 基因盒的結構與種類

2.1.1 基因盒的結構 基因盒是一種可移動性基因元件,可以環(huán)狀的形式獨立存在,也可整合入整合子中而成為整合子結構的一部分?；蚝芯哂泄餐慕Y構,由單一基因和一個位于其下游的整合位點attC(常用59 be表示)組成。attC位點是一個不完全的反向重復序列,并含有一個可被整合酶識別的特異性整合位點。59 be的長度為57～141 bp,其最高度保守的特征是兩個7 bp的核心位點:一是核心位點G TT RRRY(R:嘌呤,Y:嘧啶),位于 59 be的3′端;二是與之相對稱的反向核心位點RYYYAAC,位于 59 be的 5′端。在整合過程中,重組交換發(fā)生在59 be重組位點的3′端7 bp核心位點保守的Ga37中,59 be的特殊結構基因盒的插入和表達提供了重要的結構基礎。

2.1.2 基因盒的種類 目前發(fā)現(xiàn)已有80多種基因盒,新的基因盒還在被不斷發(fā)現(xiàn)?；蚝泻笑?內酰胺類、氨基糖苷類、頭孢類、甲氧芐啶、氯霉素、磺胺類等抗生素耐藥基因,常見的包括以下幾類:(1)aad、aac基因家族 主要表現(xiàn)對氨基糖苷抗生素的耐藥。aad基因編碼氨基糖苷腺苷?；D移酶,分為A、B兩類。目前發(fā)現(xiàn)aadA有aadA1-aadA7不同的成員,如aad A5編碼對鏈霉素、壯觀霉素的耐藥性,aadB編碼對氨基糖苷類的慶大霉素、卡那霉素、妥布霉素的耐藥性;aac基因編碼氨基糖苷乙酰轉移酶 ,目前有 aac(1)、aac(2′)、aac(3)、aac(6′)。其中aac(3)又可分為aac(3)-Ia、aac(3)-Ib、aac(3)-Ic。(2)dfr基因家族 編碼二氫葉酸還原酶(dfr),對甲氧芐啶耐藥,據(jù)編碼的酶類型不同分為A、B兩類,dfrA編碼的二氫葉酸還原酶有157～187個殘基,dfrB編碼的酶長度大約只有78個殘基[10]。(3)β-內酰胺酶和超廣譜β-內酰胺酶基因 耐氨芐西林基因盒blaPSE-1,頭孢菌素耐藥基因盒balCMY-2,及 blaVEB-1、blaGES-2、blaCTX-M22 等,還有一種新的OXA-類β-內酰胺酶基因盒,特指blaOXA-129基因(由命名中主在http://w w w.lahey.org/S tudies/獲得)[11],越來越多的此類基因盒被發(fā)現(xiàn)。(4)Ⅱ類內含子 它被發(fā)現(xiàn)能夠插入到aadA1基因盒59 be的整合酶結合的主要區(qū)域1L,Ⅱ類內含子[11]的插入方向與基因盒插入的方向相反,它是一個有424個氨基酸蛋白質的開放讀碼框(ORFII),其序列與逆轉錄酶有關。(5)其他基因 大多有甲氨嘧啶類、氯霉素、鏈霉素、紅霉素、氨基糖苷酰苷、乙酰基轉移酶耐藥基因,它們抗性基因分別是 sut1、qucE、cmlA 和 catB3、blap1 、sat 、ere 和 orf5等[12-13]。此外還包括chrA 、orfF,orf1、qacE_1。

2.2 基因盒的表達 基因盒只有在整合子中才能轉錄,現(xiàn)已知的絕大多數(shù)基因盒不含啟動子,轉錄需從整合子的啟動子開始?；蚝械谋磉_水平不僅依賴于啟動子的強弱,而且與離啟動子的距離有關(距離啟動子越近的基因盒表達率越高),在質粒上的整合子還與質粒的拷貝數(shù)有關[4]。

基因盒總是以 5′-3′的方向整合入整合子,使其可以在上游啟動子Pant的作用下得以表達?？股啬退幍木_度取決于上游基因盒的數(shù)目和性質。被捕獲的基因盒5′端與整合酶的att I結合,3′端59 be片段與attC發(fā)生特異性整合。同時整合酶也可介導attC和att I以外的第二位點的整合,稱為非特異性整合。雖然整合頻率較低,但因其周圍只有一個重組位點而不能被切除,其在細菌基因組、質粒、轉座子進化中起重要作用。整合酶介導的基因盒的剪切主要發(fā)生在兩個attC位點之間。59 be?？尚纬梢环N莖環(huán)結構,可抑制下游基因盒的表達。但下游表達較弱或不表達的基因盒在抗生素的壓力下,有可能借助整合酶介導的基因重組,插入到強啟動子或靠近Pant的位置,由低水平表達轉為高效表達,耐藥水平隨之上升。

2.3 基因盒的移動 一個整合子可以捕獲一個或多個基因盒,且同一個基因盒可以整合到不同的整合子上,從而導致基因盒的移動。整合子介導的基因盒的移動被稱作盒捕捉,其發(fā)生過程有兩種機制。第1種:整合酶從整合子(供體)中切除的一個基因盒,形成一個共價閉環(huán),然后它插入到另一整合子(受體)的attC位點;第2種:整合酶重組的供體和受體質粒,這些質粒都是由att I或者attC位點所形成的單一的共聯(lián)體質粒,它們可由整合酶分成兩個單獨的質粒,一個質粒(受體)通過盒捕捉獲得基因盒,另一質粒則失去。這兩種機制都是保守過程,它們所形成的最后的盒捕捉產(chǎn)物通過序列測定是沒有區(qū)別的[3]。

3 整合子-基因盒的檢測

目前整合子的檢測主要運用分子生物學的方法。由于第1、2、3類整合子與細菌耐藥密切相關,臨床菌株中整合子的檢測主要針對此三類整合子。

3.1 PCR檢測法 目前應用最廣泛的檢測方法,根據(jù)Ⅰ類整合子兩端保守序列及耐藥基因序列設計引物,通過PCR擴增檢測整合子和基因盒,對產(chǎn)物進行序列分析。也可用熒光定量PCR進行整合酶基因的快速檢測。

3.2 核酸雜交法 根據(jù)Ⅰ類整合子兩端保守序列設計探針,對質粒和染色體DNA進行核酸雜交檢測整合子,此外可利用基因盒探針檢測其中基因盒的種類。

3.3 其他檢測方法 Hardw ickb S A等[14]建立了一種SYBR實時定量PCR來檢測自然環(huán)境中細菌的整合子,還可以用基因芯片技術對整合子及基因盒進行檢測和分析。

4 整合子-基因盒系統(tǒng)與細菌耐藥性關系

細菌的耐藥性甚至是多重耐藥性開始大量出現(xiàn),致使抗生素的療效逐漸下降,給臨床治療帶來了極大的困難。近年來國內外對整合子的研究呈積極狀態(tài),Centron D等[15]研究了多重耐藥的粘質沙雷菌,發(fā)現(xiàn)在同一60 kb的質粒上存在3個整合子。第2個整合子上發(fā)現(xiàn)了新的氨基苷類耐藥基因ant(3′)-Ii-aac(6′)-Ⅱd,兼具 ant(3′)-I和 aac(6′)-Ⅱ的功能。隨后又出現(xiàn)一個不完整的 blaOXA-10基因,這是一種新的基因融合形式。第3個整合子上有3個已知的基因盒,它們都存在于Ⅱ類內含子上,此種復雜的結構賦予該菌明顯的多重耐藥性。Grape M等[16]報道105株尿液標本中分離的革蘭陰性細菌中59株(56.2%)整合子陽性,整合子陽性菌株平均對4.2種藥物耐藥,而整合子陰性菌株平均僅對1.9種藥物耐藥。Shi L等[17]報道46株分離自臨床標本的革蘭陽性細菌中第一類整合子的陽性率為100%,表明第一類整合子也廣泛分布于革蘭陽性細菌中。有研究分析過20株鮑曼不動桿菌,其中有1株帶有Ⅰ類和Ⅱ類的雜交整合子,說明了整合子新的進化方向。在抗生素選擇性壓力下,整合子會不斷進化,產(chǎn)生新的耐藥形式;整合子的存在方式和傳播方式的靈活性為細菌多重耐藥性傳播加速性提供了便利條件。

5 結語

研究整合子-基因盒系統(tǒng)介導和傳播細菌耐藥性及對細菌基因組的進化的影響,為闡明細菌耐藥性的分子機制提供了新思路。目前研究發(fā)現(xiàn)破壞耐藥基因就可使細菌恢復對抗菌藥物的敏感性。隨著整合子的深入研究,許多方面還有待于進一步探討:(1)整合子中基因盒的起源。(2)各類整合子出現(xiàn)頻率不同的原因。(3)快速、簡便、低廉的整合子檢測方法等。

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