王玉玲,趙祥平,王國柱,陳本龍,劉紅梅,柴銘駿,楊新梅

(1.天津出入境檢驗(yàn)檢疫局,天津 塘沽 300461;2.河北出入境檢驗(yàn)檢疫局,河北 廊坊 050051)

2009年4月,我國首次從烏拉圭進(jìn)口種牛,依據(jù)雙邊簽訂的檢疫和衛(wèi)生要求議定書,須進(jìn)行口蹄疫的檢疫。議定書中規(guī)定,在農(nóng)場(chǎng)檢疫和隔離檢疫期間對(duì)動(dòng)物逐頭進(jìn)行口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白檢測(cè),若在口蹄疫的非結(jié)構(gòu)蛋白檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)有陽性動(dòng)物,則立即從牛群中剔除,并對(duì)這些陽性動(dòng)物進(jìn)行病毒分離試驗(yàn),如仍為陽性,則立即停止向中國出口活牛。經(jīng)過中烏雙方協(xié)商,在產(chǎn)地檢疫時(shí),對(duì)該批種牛采用世界衛(wèi)生組織(WHO)PANAFTOSA實(shí)驗(yàn)室提供的FMD非結(jié)構(gòu)蛋白檢測(cè)系統(tǒng),先用口蹄疫3ABC非結(jié)構(gòu)蛋白抗體間接ELISA檢測(cè)方法篩選,對(duì)篩選出的陽性和可疑樣品再用酶聯(lián)免疫電轉(zhuǎn)移印跡試驗(yàn)(enzyme-linked immunotransfer blot,EITB),進(jìn)行確認(rèn)。在進(jìn)境隔離檢疫時(shí),對(duì)該批種牛采用了同樣的方法進(jìn)行檢測(cè),同時(shí)我們還對(duì)口蹄疫其他檢測(cè)方法進(jìn)行了應(yīng)用研究,以期尋求到在出入境檢疫或臨床檢疫中更為有效的、操作更為簡(jiǎn)便的口蹄疫檢疫方法。

1 材料與方法

1.13 ABC非結(jié)構(gòu)蛋白抗體間接ELISA試驗(yàn) 用巴西PANAFTOSA實(shí)驗(yàn)室提供的口蹄疫3ABC非結(jié)構(gòu)蛋白間接ELISA試劑盒,對(duì)3955份種牛血清樣品進(jìn)行檢測(cè)。方法按照試劑盒說明書操作。

1.2 酶聯(lián)免疫電轉(zhuǎn)移印跡試驗(yàn) 用巴西PANAFTOSA實(shí)驗(yàn)室提供的EITB試劑盒,對(duì)1.1試驗(yàn)中陽性的血清樣品進(jìn)行口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC、3D、2C、3B、3A的EITB檢測(cè)。方法按照試劑盒說明書操作。

1.33 ABC非結(jié)構(gòu)蛋白抗體阻斷ELISA試驗(yàn) 用荷蘭Cedi生產(chǎn)的口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC阻斷ELISA試劑盒,對(duì)1.1試驗(yàn)中陽性的血清樣品進(jìn)行檢測(cè)。方法按照試劑盒說明書操作。

1.4 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試驗(yàn) 用深圳太太基因工程有限公司生產(chǎn)的口蹄疫病毒通用型實(shí)時(shí)熒光RTPCR檢測(cè)試劑盒,對(duì)1.3試驗(yàn)為陽性的種牛采集抗凝血進(jìn)行檢測(cè)。方法按照試劑盒說明書操作。

2 結(jié)果與分析

2.13 ABC非結(jié)構(gòu)蛋白抗體間接ELISA試驗(yàn)

3955份樣品中,95份為陽性反應(yīng),陽性百分率為2.4%。在烏拉圭農(nóng)場(chǎng)檢疫和隔離檢疫時(shí),陽性百分率分別為4.5%和0.9%,說明在國內(nèi)隔離檢疫時(shí)3ABC間接ELISA試驗(yàn)的陽性百分率,與國外檢疫時(shí)的基本相符(見表1)。

表1 巴西口蹄疫檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)結(jié)果

2.2 酶聯(lián)免疫電轉(zhuǎn)移印跡試驗(yàn) 對(duì)2.1中篩選出的95份陽性血清樣品進(jìn)行EITB檢測(cè),結(jié)果(見表2)是95份樣品均為EITB試驗(yàn)陰性,依此最終判定95份樣品為口蹄疫陰性。說明2.1中篩選的95份為口蹄疫非特異性反應(yīng)。

2.33 ABC非結(jié)構(gòu)蛋白抗體阻斷ELISA試驗(yàn) 對(duì)2.1中篩選出的95份陽性血清樣品進(jìn)行口蹄疫3ABC非結(jié)構(gòu)蛋白阻斷ELISA檢測(cè),結(jié)果有1份樣品(樣品號(hào)為42)為陽性反應(yīng),其余94份樣品為陰性反應(yīng)。

2.4 實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR試驗(yàn) 對(duì)42號(hào)動(dòng)物采集抗凝血,同時(shí)采集了19頭種?？鼓?進(jìn)行口蹄疫實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè),結(jié)果是42號(hào)樣品和另外19份樣品均為陰性。該19份樣品為巴西PANAF TOSA 3ABC非結(jié)構(gòu)蛋白間接ELISA陽性,荷蘭Cedi口蹄疫3ABC非結(jié)構(gòu)蛋白阻斷ELISA陰性。結(jié)果說明,荷蘭Cedi ELISA檢測(cè)的結(jié)果與RT-PCR符合率較高。

3 討論

圖1 口蹄疫實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

3.1 口蹄疫的實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要有病原鑒定和血清學(xué)試驗(yàn),病原鑒定主要有病毒分離、免疫學(xué)方法和核酸識(shí)別方法,血清學(xué)試驗(yàn)主要有病毒中和試驗(yàn)、ELISA、EITB試驗(yàn)[1]。病毒分離及病毒中和試驗(yàn)都需要用到口蹄疫病毒毒株,需在許可的具有資質(zhì)的生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,此類試驗(yàn)的應(yīng)用受到限制。免疫學(xué)方法在病原鑒定時(shí)由于涉及到樣品采集的限制也很少被采用。基于此,我們主要對(duì)核酸識(shí)別方法、ELISA和EITB在實(shí)際檢測(cè)中進(jìn)行了應(yīng)用研究。目前在口蹄疫出入境檢疫或臨床檢疫時(shí),通常是先采用血清學(xué)試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè),出現(xiàn)陽性結(jié)果的樣品再采用病原鑒定的方法進(jìn)一步確診。

3.2 從表1中可以看出,不論是在國內(nèi)隔離檢疫還是在國外農(nóng)場(chǎng)檢疫和隔離檢疫,用3ABC間接ELISA篩選出的陽性樣品,經(jīng)EITB確認(rèn)后均為陰性,說明巴西PANAFTOSA的3ABC非結(jié)構(gòu)蛋白間接ELISA試劑盒的假陽性率較高。

表2 EITB檢測(cè)結(jié)果

EITB是將 3ABC、3D、2C、3B、3A 蛋白固定在硝化纖維素條帶上,當(dāng)血清樣品中有特異抗體時(shí),產(chǎn)生抗原抗體免疫復(fù)合體,與結(jié)合物結(jié)合后,加入底物發(fā)生顏色反應(yīng),與弱陽性對(duì)照上條帶比對(duì),如果在3ABC、3D、3B、3A 處都產(chǎn)生條帶,且顏色等于或深于弱陽性對(duì)照時(shí),判定該樣品為EITB陽性。

由于EITB是一種免疫印跡試驗(yàn),其結(jié)果比3ABC非結(jié)構(gòu)蛋白間接ELISA方法更加準(zhǔn)確。在南美被廣泛應(yīng)用的血清學(xué)檢測(cè)體系時(shí),先用3ABC非結(jié)構(gòu)蛋白間接ELISA進(jìn)行口蹄疫篩選試驗(yàn),然后用EITB作確認(rèn)試驗(yàn)。但EITB操作較復(fù)雜,判定結(jié)果時(shí)需眼觀判定,受主觀因素影響較強(qiáng)。

3.3 從荷蘭Cedi 3ABC非結(jié)構(gòu)蛋白阻斷ELISA檢測(cè)的結(jié)果看,95份樣品中只有1份為陽性反應(yīng),94份均檢測(cè)為陰性,說明該試劑盒假陽性反應(yīng)較少。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[2],對(duì)市售的 UBI、Chekit、Cedi三種ELISA非結(jié)構(gòu)蛋白試劑盒進(jìn)行比對(duì),結(jié)果說明荷蘭Cedi 3ABC阻斷ELISA的特異性和敏感性是最高的,與疫苗中殘留的非結(jié)構(gòu)蛋白的反應(yīng)也是最低的。通過試驗(yàn)結(jié)果說明,荷蘭Cedi3ABC非結(jié)構(gòu)蛋白阻斷ELISA檢測(cè)的結(jié)果最符合種牛機(jī)體口蹄疫感染的實(shí)際情況。建議在出入境檢疫或臨床檢疫中可將荷蘭Cedi 3ABC非結(jié)構(gòu)蛋白阻斷ELISA作為首選的口蹄疫血清學(xué)檢測(cè)方法。

3.4 通過2.4試驗(yàn)結(jié)果可以看到,42號(hào)和另外采集的19份抗凝血樣品均為 RT-PCR陰性,與流行病學(xué)觀察的結(jié)果相符(經(jīng)臨床觀察,20頭牛健康狀況良好,無任何疾病癥狀)。有文獻(xiàn)證明[3],實(shí)時(shí)RT-PCR的敏感性可比得上病毒分離。通過實(shí)際應(yīng)用,實(shí)時(shí)熒光RT-PCR不涉及到口蹄疫病毒毒株,且方法快速簡(jiǎn)便,敏感性和特異性較高,可用于臨床檢疫中的口蹄疫病原鑒定。建議對(duì)血清學(xué)檢測(cè)為抗體陽性的動(dòng)物采用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法進(jìn)行口蹄疫病原檢測(cè)。

[1] OIE.Man ual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals[EB/O L].http://ww w.oie.in t/en_index.h tm,2009-8-26.

[2] Chen S P,Ellis T M,Lee M C,et al.Com parison of sensitivity and specificity in th ree commercial foot-and-mouth disease virus non-structu ral protein E LIS A kits with sw ine sera in Taiw an[J].Vet Microbiol,2007,119(2-4):164-172.

[3] Reid S M,G rierson S S,Ferris N P,et al.Evaluation of automated RT-PCR to accelerate the laboratory diagnosis of footand-m ou th disease virus[J].J Virol M ethods,2003,107(2):129-139.