西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 韓水仲 田澤華 趙津子 張小鶯＊

陜 西 理 工 學(xué) 院 陳琛

卵黃抗體（IgY）是從經(jīng)過免疫注射特定抗原的產(chǎn)蛋雞卵黃中提取的特異性抗體。相對(duì)于哺乳動(dòng)物，由于種系發(fā)生學(xué)距離的優(yōu)勢(shì)，禽更適合生產(chǎn)針對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)菌和病毒性疾病的抗體，而對(duì)腸道正常的菌群無副作用，避免產(chǎn)生藥物殘留和耐藥性。卵黃抗體具有產(chǎn)量高，制備簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低，便于大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，并且理化性質(zhì)穩(wěn)定，具有一定的抗酶解能力（張小鶯等，2004）。飼喂含卵黃抗體的飼料在節(jié)約成本的同時(shí)，能夠有效預(yù)防疾病，增強(qiáng)機(jī)體的免疫機(jī)能，且卵黃本身也是很好的蛋白來源，卵黃中除了含有特異性卵黃抗體外還含有蛋氨酸、丙氨酸、甘氨酸等多種氨基酸，同時(shí)還含有卵黃高磷蛋白、唾液酸、低聚糖等抗細(xì)菌和病毒、免疫調(diào)節(jié)等功能生物活性物質(zhì)，這增加了其作為飼料添加劑的優(yōu)勢(shì)。

1 IgY的理化性質(zhì)

IgY是一種7 S免疫球蛋白，與哺乳動(dòng)物IgG略有不同，等電點(diǎn)為5.7～7.6，分子質(zhì)量約為180 ku，由兩條輕鏈和兩條重鏈組成，分子質(zhì)量分別為22～30 ku和60～70 ku。IgY的pH值穩(wěn)定性較好，活性保持良好，在pH 4.0～11.0時(shí)比較穩(wěn)定，pH 3.0～3.5時(shí)活性迅速下降，pH 12.0時(shí)活性亦有所下降，在pH>12.0時(shí)迅速失活。IgY也具有良好的耐熱能力。在低于75℃條件下，IgY具有良好的熱穩(wěn)定性；65℃，可保持24 h以上，70℃時(shí)加熱90 min后其活性才明顯下降，高于80℃，大部分IgY將失去活性。IgY制劑在4℃貯存5年或在室溫貯存6個(gè)月其活性仍無明顯變化或下降；IgY對(duì)胃蛋白酶有較好的抵抗力，但對(duì)胰蛋白酶十分敏感（張小鶯等，2004）。在通常情況下，IgY基本能耐受巴氏消毒；IgY具有耐高滲性能 （在60%的高濃度蔗糖溶液中仍有活性）和很好的耐反復(fù)凍融的特性。IgY還有一些不同于哺乳動(dòng)物IgY的特殊生物學(xué)特性，它不與金黃色葡萄球菌C蛋白結(jié)合，不與哺乳動(dòng)物DE受體結(jié)合，不與類風(fēng)濕因子發(fā)生非特異性反應(yīng)，對(duì)哺乳動(dòng)物補(bǔ)體無固定作用，因而在檢測(cè)診斷中特異性強(qiáng)，靈敏度高。

2 IgY的提取

IgY的純化方法很多，生產(chǎn)上根據(jù)抗體純度的要求，結(jié)合生產(chǎn)成本，考慮到對(duì)環(huán)境的影響，選擇不同的方法。生產(chǎn)IgY添加劑，可以對(duì)卵黃進(jìn)行粗提取。粗提主要有水稀釋法、有機(jī)物沉淀法、有機(jī)溶劑抽提法和生物制劑提取法等，其中水稀釋法最為簡(jiǎn)單和經(jīng)濟(jì)，利用卵黃抗體可溶于水的特性，除去不溶的脂蛋白。Akita等（1994）使用此法，每毫升卵黃中獲得9.8 mg的抗體，回收率達(dá)到了91%。有機(jī)物沉淀法使用的有機(jī)溶劑主要有PEG6000、硫酸葡聚糖等，有機(jī)溶劑如氯仿，生物制劑如角叉藻膠等也都能夠較好地去除脂蛋白，獲得卵黃抗體。IgY的進(jìn)一步純化，可以使用層析技術(shù)，常用的有凝膠層析和離子交換層析法，兩種方法對(duì)IgY活性影響較?。ńе?，2000）。此外，也有用親硫?qū)游?、超濾等方法對(duì)IgY進(jìn)行純化。特異性IgY的獲得可以使用親和層析進(jìn)行，獲得的IgY特異性好、純度高，但其成本較高。

3 IgY的穩(wěn)定性保護(hù)

卵黃抗體為免疫球蛋白，作為添加劑，如何有效保護(hù)其在胃腸道內(nèi)不被消化酶水解，同時(shí)在胃腸道酸堿環(huán)境下保持其穩(wěn)定性，是發(fā)揮其作用的首要問題。對(duì)于幼齡動(dòng)物，消化系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，IgY可抵抗其消化酶的消化，故可將一定量的針對(duì)某些疾病的IgY添加到飼料或飲用水中，使幼齡動(dòng)物獲得被動(dòng)免疫保護(hù)。對(duì)于成年動(dòng)物，為了減少添加的IgY的損失，可采用一定的措施，如IgY的優(yōu)化和設(shè)計(jì)。

Shimizu等（1992）用蛋黃中提取的卵磷脂和膽固醇為壁材，用脫水-復(fù)水法對(duì)IgY進(jìn)行包埋，制成脂質(zhì)體，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體包埋的IgY在酸性條件下穩(wěn)定性顯著提高，在pH 2.8條件下處理1 h后，穩(wěn)定性變化不大。Shimizu等（1994）發(fā)現(xiàn)，在IgY溶液中加入30%～50%的蔗糖或轉(zhuǎn)化糖可顯著提高IgY在75～80℃的抗熱變性和在pH 3.0時(shí)的抗酸變性能力。此外，檸檬酸鹽、磷酸鹽、葡萄糖、山梨醇、蔗糖、乳糖等對(duì)IgY的熱穩(wěn)定性均有一定保護(hù)作用。Li等（2009）研究了以殼聚糖-海藻酸鈉微囊為載體對(duì)卵黃抗體的口服保護(hù)效果。在pH 5.0獲得了最佳的空白微囊，裝載IgY后負(fù)載率達(dá)到了16.72% ～19.69%，pH 3～6對(duì)負(fù)載率無影響，抗體包封率在pH 3.5時(shí)可達(dá)最大，即73.93%，但是隨pH下降而降低。通過包被保護(hù)，IgY在模擬胃液中的穩(wěn)定性明顯加強(qiáng)，處理2 h后，仍然保留61.36%～74.61%的活性，同時(shí)載體對(duì)IgY的釋放率的影響可以忽略。將包被的IgY置于模擬腸液中，微囊開始降解，使IgY獲得持續(xù)釋放，同時(shí)有一個(gè)療效的突增點(diǎn)。殼聚糖、海藻酸鈉是聚合電解質(zhì)，兩者帶有相反的電荷，靜電吸引下可以形成混合聚合電解質(zhì)膜，反應(yīng)條件溫和，可以保留生物大分子的很大部分活性。

4 IgY添加劑在動(dòng)物養(yǎng)殖及飼料方面的應(yīng)用

4.1 IgY添加劑在仔豬生產(chǎn)中的應(yīng)用

4.1.1 IgY添加劑防治仔豬細(xì)菌型腹瀉 細(xì)菌是導(dǎo)致仔豬腹瀉的直接原因，大腸埃希菌（E.coli）是主要的致病菌。IgY可附著在細(xì)菌的細(xì)胞膜上，改變細(xì)胞膜完整性或附著在細(xì)菌的菌毛上，阻止與腸絨毛細(xì)胞上的菌毛受體結(jié)合，使E.coli無法黏附在小腸黏膜上，或變?yōu)榉遣≡懦鲶w外。Yokoyama等（1992）通過體外黏著抑制試驗(yàn)證實(shí)了上述作用。高云英等 （2003）將K88+、K99和987P滅活后，等量混合免疫產(chǎn)蛋雞，仔豬口服卵黃抗體，預(yù)防保護(hù)試驗(yàn)達(dá)到90%以上，攻毒保護(hù)試驗(yàn)達(dá)到98%，試驗(yàn)顯示卵黃抗體在治療上優(yōu)于痢特靈和慶大霉素。

在選擇試驗(yàn)菌株時(shí)，大部分人選用標(biāo)準(zhǔn)菌株，也有一些研究者選用地方株，如Marquardt等（1999）用地方株 ETEC（K88+）誘導(dǎo)腹瀉的 3 日齡仔豬，在用卵黃抗體后24 h被治愈，而用未免疫母雞蛋黃粉處理組仔豬繼續(xù)腹瀉，其中62.5%因嚴(yán)重腹瀉而死亡。在21日齡斷奶仔豬的感染試驗(yàn)中，飼喂卵黃抗體粉后有短暫的腹瀉，試驗(yàn)期間100%存活，且體重明顯增加，而對(duì)照組則出現(xiàn)嚴(yán)重的腹瀉和脫水癥狀，且48 h內(nèi)有仔豬死亡。對(duì)豬場(chǎng)14～18日齡的斷奶仔豬的飼喂試驗(yàn)表明，飼喂含卵黃抗體日糧的仔豬腹瀉發(fā)生率和嚴(yán)重程度上均比飼喂含抗菌素的商品日糧組低。

Owusu-Asiedu等（2003）研究發(fā)現(xiàn)，人工感染E.coli后，不添加IgY的PPI組嚴(yán)重腹瀉，并持續(xù)7 d，有33%的死亡率，而添加IgY組只發(fā)生輕微腹瀉。在檢查糞便時(shí)，75%在感染6 h后都呈陽性，但24 h后，PPI組中添加IgY組只有50%檢查出K88+，而對(duì)照100%檢出，顯示出IgY在抵抗ETEC（K88+）能夠提供被動(dòng)保護(hù)，特別是在以植物蛋白為飼料的情況下，能夠改善采食量，使斷奶仔豬增重。王吉譚等（2004）使用含有抗K88+、K99和987P的卵黃抗體粉飼喂斷奶仔豬后發(fā)現(xiàn)，飼喂2周高免全蛋粉能顯著提高日采食量、平均日增重和飼料轉(zhuǎn)化率，效果與血漿蛋白組相似，并且有提高采食量的趨勢(shì)，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)飼喂高免全蛋粉能有效防治斷奶仔豬腹瀉，日糧中添加卵黃抗體能顯著降低腸道中大腸桿菌數(shù)，增加絨毛高度，降低隱窩深度，在獲得與血漿蛋白相同的生產(chǎn)性能條件下，較大地降低了生產(chǎn)成本。

4.1.2 IgY添加劑防治仔豬病毒性腹瀉 豬流行性腹瀉病毒 （PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）是引起豬發(fā)生腹瀉主要病毒性病原體，發(fā)病率、死亡率較高，給養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。對(duì)于曾發(fā)生過PEDV的豬場(chǎng)或接種過PEDV弱毒疫苗的妊娠母豬，仔豬主要通過吸食初乳來獲得對(duì)PEDV的抵抗力，而一旦暴發(fā)豬流行性腹瀉，目前尚沒有特別有效的防治措施。卵黃抗體與初乳作用機(jī)理相似，仔豬口服IgY或?qū)gY添加到飼料中可以提高仔豬的免疫力。Kweon等（2000）使用PEDV免疫雞，然后提取和濃縮卵黃抗體（I-gY），在仔豬人工感染PEDV后，口服IgY的仔豬，存活率達(dá)到85%，而對(duì)照組存活率僅為53%。同時(shí)，為了測(cè)定IgY的預(yù)防效果，在PEDV陽性的三個(gè)農(nóng)場(chǎng)對(duì)出現(xiàn)腹瀉癥狀的仔豬口服IgY進(jìn)行治療，雖然三個(gè)農(nóng)場(chǎng)的存活率有些變化，但是總體上，使用IgY治療的仔豬存活率為49.24%，而對(duì)照組為33.71%，效果明顯。宋維平和徐福（2003）使用抗PEDV的卵黃液飼喂感染仔豬，治療組的死亡率僅為16.7%，相對(duì)于全部死亡的對(duì)照組，差異極顯著。TGEV可導(dǎo)致2周齡仔豬大規(guī)模死亡，Zuo等（2009）發(fā)現(xiàn)，缺乏母源抗體的仔豬，口服抗TGEV的卵黃抗體，人工感染TGEV后，死亡率僅為12.5%，而對(duì)照組高達(dá)50%，在發(fā)生TGEV的兩個(gè)豬場(chǎng)，口服卵黃抗體的仔豬存活率為82.35%，對(duì)照組為36.84%，差異顯著。

4.1.3 IgY添加劑對(duì)豬生產(chǎn)性能的影響 飼喂特異性卵黃抗體能夠提高增重和豬肉產(chǎn)品的質(zhì)量。姜錦鵬等（2007）使用脂肪組織細(xì)胞膜蛋白制得的卵黃抗體，在豬的生長(zhǎng)前期飼喂添加卵黃抗體（75 mg/kg），平均日增重提高了13.03%，飼料報(bào)酬率提高7.49%，瘦肉率提高10.3%，背膘厚下降24.14%，腎周、腸系膜、皮下脂肪指數(shù)都下降，并可改善肉色。膽囊收縮素（CCK）是一種重要的內(nèi)源性生理飽感因子，參與攝食和體重調(diào)節(jié)。脂肪細(xì)胞膜蛋白卵黃抗體可抑制前脂肪細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而影響脂肪合成，但是其對(duì)脂肪細(xì)胞無明顯的細(xì)胞毒作用。余冰和林曉欽（2009）研究了含膽囊收縮素（CCK）抗體的卵黃粉對(duì)斷奶仔豬生產(chǎn)性能及養(yǎng)分消化率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組仔豬血清中CCK濃度下降，試驗(yàn)組平均日采食量（ADFI）提高了6.92%、平均日增重（ADG）增加了 12.14%，料肉比（F/G）降低了4.62%，同時(shí)，隨著含CCK抗體卵黃粉添加水平的增加，粗蛋白質(zhì)消化率隨添加量增加呈二次曲線變化。

4.2 IgY添加劑在養(yǎng)禽上的應(yīng)用

4.2.1 IgY添加劑在防治禽細(xì)菌性疾病的應(yīng)用Lee等（2002）研制的抗腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門菌制備的卵黃抗體，在體外抑菌試驗(yàn)中，0.9 mg/mL的抗腸炎沙門氏菌卵黃抗體能夠顯著抑制腸炎沙門氏菌的生長(zhǎng)，0.63 mg/mL的抗鼠傷寒沙門氏菌也出現(xiàn)同樣情況，但是抑制效果不如抗腸炎沙門氏菌卵黃抗體，免疫熒光和免疫電鏡能夠觀察到卵黃抗體特異地結(jié)合到細(xì)菌表面抗原。Rahimi等（2007a）分別使用含抗沙門氏菌的卵黃抗體粉和不含抗沙門氏菌的卵黃抗體粉，卵清和少量奶粉等作為飼料飼喂雛雞。在人工感染試驗(yàn)中，飼喂添加有卵黃抗體粉的雛雞在試驗(yàn)期間，糞便中分離到沙門氏菌的數(shù)量相對(duì)于未添加組顯著降低，28日齡時(shí)，糞便中未分離到沙門菌，在對(duì)腸內(nèi)容物分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，使用卵黃抗體組相對(duì)于對(duì)照組，沙門菌濃度顯著降低，說明卵黃抗體可以抑制沙門菌在腸黏膜上黏附，并且在肝臟、脾臟、回腸的組織學(xué)檢查中，卵黃抗體組沙門氏菌量顯著低于對(duì)照組。

Mahdavi等（2010）研究發(fā)現(xiàn)，感染 E.coli O78∶K80的雛雞，回腸中含有較多的E.coli O78∶K80，同時(shí)其白細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞比例、血液和腸道中分泌型IgA的濃度，空腸中球狀細(xì)胞、淋巴濾泡的數(shù)量等都提高。在將抗E.coli O78∶K80卵黃抗體添加到飼料中飼喂雛雞后，發(fā)現(xiàn)飼喂含0.2%和0.4%特異性IgY和0.4%非特異性IgY對(duì)感染雛雞回腸中E.coli O78∶K80的增殖抑制作用明顯。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，飼喂特異和非特異性的卵黃抗體能夠增加腸絨毛的高度和隱窩深度，并能降低空腸中球狀細(xì)胞和淋巴濾泡的數(shù)目。結(jié)果顯示，口服3周含0.2%特異性的卵黃抗體能夠改變腸道健康指數(shù)和雛雞對(duì)O78∶K80的免疫應(yīng)答。此外也有報(bào)道用卵黃抗體預(yù)防和治療火雞和蛋雞中的彎曲菌病，如Tsuokura等（1997）使用卵黃抗體在雞中進(jìn)行預(yù)防和治療實(shí)驗(yàn)，在預(yù)防試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，卵黃抗體能顯著減少糞便中彎曲菌的數(shù)量（達(dá)到99%），但是治療組效果低于預(yù)防組（80～85%）。

4.2.2 IgY添加劑在防治禽病毒性疾病的應(yīng)用卵黃抗體除了能很好地治療傳染性法氏囊外，在其他病毒性疾病方面也有廣泛應(yīng)用。Rahimi等（2007b）使用滅活的H9N2禽流感病毒制得的卵黃抗體，飲用含有此卵黃抗體（15 mL/3.84 L）的雛雞，在鼻內(nèi)人工感染病毒進(jìn)行攻毒試驗(yàn)時(shí)，其糞便中病毒的含量?jī)H為12.5%，而對(duì)照組為87.5%，差異極顯著。于可響等（2008）使用四株鴨肝炎病毒（DHV）地方株制得的卵黃抗體保護(hù)雛鴨效果明顯，試驗(yàn)組死亡率比攻毒組顯著降低，治療效果也比較明顯，雛鴨存活率達(dá)到70%以上。李建鑫和吳憶春（2006）研究發(fā)現(xiàn)，在感染DHV后24 h，對(duì)雛鴨肌注卵黃抗體保護(hù)作用最好。

4.2.3 IgY添加劑對(duì)禽生產(chǎn)性能的影響 飼喂含有卵黃抗體的飼料不僅能夠預(yù)防疾病，同時(shí)也能提高動(dòng)物增重率。朱錦蘭和李煥友 （2004）將抗K88、K99、p987 卵 黃 抗 體 添 加 到 肉 鴨 飼 料（0.1%），結(jié)果表明，試驗(yàn)組日增重顯著高于對(duì)照組，在幼鴨階段，試驗(yàn)組料重比比對(duì)照組低，且差異顯著，但是在大鴨階段，試驗(yàn)組雖然比對(duì)照組低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，在對(duì)胰蛋白酶的活性測(cè)定中發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組各小腸段的胰蛋白酶活性分別比對(duì)照組高10.79%，可以提高肉鴨對(duì)蛋白質(zhì)的消化利用。試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)卵黃抗體可以提高外周血液中甲狀腺激素的含量，特別是T3。Decuypere等（2005）研究表明，血液T3水平與禽類生長(zhǎng)正相關(guān)，提示卵黃抗體影響甲狀腺激素水平參與禽類生長(zhǎng)的調(diào)控作用，從而提高肉鴨生長(zhǎng)率，并且試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肉鴨血液中胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF-1）也出現(xiàn)提高。IGF-1是哺乳動(dòng)物和禽類真正的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，生長(zhǎng)激素（GH）的促生長(zhǎng)作用通過IGF-1介導(dǎo)。同時(shí)，研究者還研究了卵黃抗體和金霉素聯(lián)用對(duì)肉鴨生長(zhǎng)性能的影響，結(jié)果表明，卵黃抗體和金霉素合用在顯著降低采食量的情況下，提高日增重、胸肌率、腿肌率，降低了腹脂率。

4.3 IgY添加劑在水產(chǎn)上的應(yīng)用 李肖梁等（2006）使用滅活的嗜水氣單胞菌免疫產(chǎn)蛋雞，將獲得的卵黃加入一定的賦型劑干燥后添加到中華鱉飼料中，研究表明，添加2‰抗嗜水氣單胞菌卵黃組平均日增重比對(duì)照組和2‰無特異性IgY添加劑組提高0.148 g，差異顯著，而平均死亡率降低了66.7%、45.5%，同時(shí)添加2‰抗嗜水氣單胞菌卵黃組平均攝食時(shí)間比對(duì)照組縮短了24.15%。攻毒試驗(yàn)顯示添加2‰抗嗜水氣單胞菌卵黃組死亡率比對(duì)照組和2‰無特異性IgY組分別降低了80.8%和79.2%，腎臟中細(xì)菌數(shù)也明顯減少。

Kim等 （2004）將對(duì)蝦白斑綜合癥病毒（WSSV）的外殼蛋白基因 VP28、VP19融合成TrVP 28∶19在E.coli表達(dá)，將表達(dá)產(chǎn)物作為抗原免疫獲得IgY后，用來對(duì)中國對(duì)蝦進(jìn)行人工感染保護(hù)試驗(yàn)，陽性保護(hù)率達(dá)到80%以上，然而在保護(hù)率和劑量上并沒有呈現(xiàn)劑量相關(guān)性，提示IgY在使用中可能并不是劑量越大越好，而是有最佳濃度。雷勇（2006）制備的抗WSSV的卵黃抗體添加到對(duì)蝦基礎(chǔ)日糧中，結(jié)果20%的卵黃添加量能夠在一定程度上延緩螯蝦的死亡時(shí)間，而40%的卵黃添加量則能使螯蝦死亡率從100%降至30%。劉君君（2007）制備的WSSV-IgY，在對(duì)克氏螯蝦攻毒保護(hù)性試驗(yàn)中，試驗(yàn)組死亡率為20%，添加有1%WSSV-IgY蛋白粉和10%的WSSV-卵黃粉組的死亡率分別降低至53.3%、67.7%。在浸泡被動(dòng)免疫試驗(yàn)中，WSSV-IgY浸泡組的死亡率為26.7%。Lu等（2009）比較了抗WSSV的IgY和DNA疫苗的免疫保護(hù)效果，顯示IgY能夠有效保護(hù)小龍蝦，無論是在使用IgY前，還是使用IgY后接種WSSV后，都能有效保護(hù)小龍蝦，死亡率僅為20%，顯著低于疫苗組的80%。

5 結(jié)語

近年來，卵黃抗體作為潛在的飼料添加劑發(fā)展較為迅速，目前已經(jīng)有相關(guān)產(chǎn)品問世。研究表明，飼喂含有抗犬細(xì)小病毒、狂犬病、傳染性肝炎、犬副流感、犬冠狀病毒的卵黃抗體的飼料，可以有效降低斷奶幼犬腹瀉、血便和呼吸道等疾病，提高幼犬的成活率。但卵黃抗體作為添加劑進(jìn)行大規(guī)模的應(yīng)用還存在一定的問題，如特異性菌株的選擇問題，卵黃抗體的穩(wěn)定性保護(hù)和貯存、污染防治等問題，但是可以預(yù)見，其在飼料添加劑中可能具有很好的前景。

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