盛明巍 趙玉軍 沈國(guó)順 林 穎

可飼(食)疫苗是通過將病原體內(nèi)提取的免疫原基因與適當(dāng)?shù)哪艽偈乖摶蚧罨膯?dòng)子一同植入植物的基因組中，使重組的外源蛋白在該植物的可食用部分穩(wěn)定地表達(dá)和積累，從而使人類和動(dòng)物的免疫接種通過攝食這些經(jīng)過基因工程改造過的植物而實(shí)現(xiàn)——即以轉(zhuǎn)基因植物為疫苗抗原的抗原傳輸載體，通過動(dòng)物或人類的進(jìn)食刺激腸粘膜系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答引發(fā)免疫反應(yīng)。

1.可飼(食)疫苗的免疫機(jī)制

1.1 粘膜免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)

發(fā)生粘膜免疫的場(chǎng)所主要是一種特化扁平上皮細(xì)胞——微褶細(xì)胞(M細(xì)胞)，其功能是選擇性粘附、攝取外來抗原物質(zhì)并以小囊泡形式轉(zhuǎn)運(yùn)給上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞及生發(fā)中心，誘導(dǎo)粘膜免疫應(yīng)答；微褶細(xì)胞在腸道派伊爾結(jié)(PP)中，與腸上皮細(xì)胞緊密排列在一起，呈圓頂狀，細(xì)胞基底部向頂部(腸腔面)內(nèi)陷呈袋狀，其中含有豐富的淋巴細(xì)胞，頂部及周邊胞質(zhì)很薄，胞質(zhì)中含有大量的吞飲小泡，微褶細(xì)胞的基底膜常是不連續(xù)的，允許淋巴細(xì)胞自由穿過。微褶細(xì)胞這些特殊結(jié)構(gòu)大大縮短了含有抗原或病原微生物的吞飲小泡跨越微褶細(xì)胞的距離，這有利于抗原迅速進(jìn)入上皮下淋巴組織。由于微褶細(xì)胞表面覆蓋著各利：與其選擇性粘附、內(nèi)吞、轉(zhuǎn)運(yùn)外來抗原有關(guān)的糖蛋白，因此微褶細(xì)胞能夠識(shí)別和區(qū)分普通食物抗原、正常菌群和病原性抗原，以保證人體免疫功能的正常運(yùn)行，對(duì)粘膜疫苗的應(yīng)用及藥物的傳送具有重要意義。由于微褶細(xì)胞不表達(dá)Ⅱ類組織相容性抗原分子，且細(xì)胞中降解蛋白質(zhì)的溶酶體很少，因此微褶細(xì)胞可能不參與對(duì)抗原的加工和處理。在微褶細(xì)胞吞噬外來抗原物質(zhì)并以小囊泡的形式轉(zhuǎn)運(yùn)至上皮下生發(fā)中心后，抗原被抗原呈遞細(xì)胞(APC)加工、處理并呈遞給B淋巴細(xì)胞，產(chǎn)生抗原特異性的淋巴母細(xì)胞，在生發(fā)中心增殖后通過血液遷移到遠(yuǎn)處的粘膜和腺體組織，并進(jìn)一步分化、成熟為漿細(xì)胞，漿細(xì)胞分泌IgA形成雙體，選擇性地與上皮細(xì)胞聚合，通過封閉細(xì)菌和病毒對(duì)粘膜上皮細(xì)胞粘附來阻止病原微生物的侵入，同樣還能中和細(xì)菌產(chǎn)生的毒素和滅活已經(jīng)侵入上皮細(xì)胞的病毒。

1.2 粘膜免疫應(yīng)答的效應(yīng)

粘膜免疫效應(yīng)部位主要包括上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞(IEL)和固有層淋巴細(xì)胞(LPL)。上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞是體內(nèi)最大的淋巴細(xì)胞群，由于它們離腸腔很近，這就使得上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞成為粘膜免疫系統(tǒng)中首先與外源抗原接觸的成分。上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞中有63%～80%為CD8+淋巴細(xì)胞，少數(shù)為CD4+淋巴細(xì)胞。研究結(jié)果表明，上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞有與細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞相似的胞內(nèi)顆粒，并能分泌腫瘤壞死因子(TNF)-α、干擾素(IFN)-γ等淋巴因子，因此上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞具有細(xì)胞殺傷和防御腸道病原體入侵的作用。固有層淋巴細(xì)胞位于粘膜固有層，含豐富的T、B淋巴細(xì)胞，是IgA抗體產(chǎn)生的主要場(chǎng)所。漿細(xì)胞所分泌的大量IgA可通過分泌片的介導(dǎo)進(jìn)入粘膜表面，中和抗原物質(zhì)，清除外來抗原。

1.3 公共粘膜免疫系統(tǒng)

1964年，JamesC發(fā)現(xiàn)粘膜致敏、活化的淋巴細(xì)胞經(jīng)導(dǎo)管、血液后又落戶于粘膜效應(yīng)部位發(fā)揮作用，而外周組織中活化的淋巴細(xì)胞就不會(huì)進(jìn)入粘膜，粘膜細(xì)胞的這種歸巢性使在粘膜某處致敏的淋巴細(xì)胞可以傳播到粘膜組織的各個(gè)部位，稱之為公共粘膜免疫系統(tǒng)，這是粘膜疫苗作用發(fā)揮的基礎(chǔ)。因此，預(yù)防消化道、呼吸道和生殖泌尿道傳染病可通過口服途徑接種疫苗來產(chǎn)生有效的粘膜免疫反應(yīng)。

此外，可飼(食)疫苗不但能夠激發(fā)粘膜免疫反應(yīng)，而且能夠激發(fā)體液免疫反應(yīng)，獲得防御疾病的能力。

2.植物源性疫苗的優(yōu)勢(shì)

植物源性疫苗生物活性高，植物表達(dá)的許多外源蛋白的生理生化特性、生物學(xué)活性與天然蛋白相同；安全性高，可避免交叉感染；遺傳的穩(wěn)定性好；成本低，不需要復(fù)雜的醫(yī)療設(shè)備；無倫理性問題；比傳統(tǒng)的免疫途徑更有效；易于儲(chǔ)存和分發(fā)，不需要冷藏設(shè)備，可以隨時(shí)長(zhǎng)期給藥；不僅提供了疫苗，而且提供了營(yíng)養(yǎng)；植物細(xì)胞壁有天然“生物膠囊”作用；在病原體和寄主相互作用的起始位點(diǎn)上能直接誘導(dǎo)強(qiáng)烈的粘膜免疫反應(yīng)。利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)口服疫苗可以實(shí)現(xiàn)多價(jià)疫苗的價(jià)值，即吃一種植物可以同時(shí)抵抗多種疾病。

3.存在的問題及應(yīng)對(duì)策略

3.1 提高外源基因表達(dá)水平，克服轉(zhuǎn)基因沉默的應(yīng)對(duì)策略分析

外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)受到抑制的現(xiàn)象稱之為轉(zhuǎn)基因沉默?；虺聊饕婕巴庠椿蛑g或外源基因和植物內(nèi)源基因之間的相互作用，最重要的原因是存在多拷貝的同源DNA序列，包括蛋白質(zhì)編碼區(qū)及啟動(dòng)子等調(diào)控序列。

3.1.1 啟動(dòng)子的選擇

啟動(dòng)子能調(diào)控外源基因在植物愁因轉(zhuǎn)化體內(nèi)特定的時(shí)空秩序或在外源誘導(dǎo)因子的作用下呈現(xiàn)特異性表達(dá)，一方面可提高表達(dá)效果和表達(dá)水平，另一方面可節(jié)省生物能耗，減小外源基因?qū)χ参锉旧淼挠绊?。特異性啟?dòng)子主要包括組織特異性啟動(dòng)子和誘導(dǎo)特異性啟動(dòng)子。

3.1.2 抗原在植物細(xì)胞器內(nèi)的定位表達(dá)

通過連接適當(dāng)?shù)亩ㄎ恍盘?hào)序列等方法修飾外源基因，使外源蛋白產(chǎn)生后能定向運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)的特定部位，蛋白特異性地表達(dá)并聚集于葉綠體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器內(nèi)，增強(qiáng)蛋白的表達(dá)功能，這些細(xì)胞器的質(zhì)膜還可以起到保護(hù)所表達(dá)抗原的作用，從而增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物作為疫苗的效能。

3.1.3 位置效應(yīng)的消除

在遺傳轉(zhuǎn)化中將核基質(zhì)結(jié)合區(qū)(MAR)置于目的基因的兩側(cè)，降低不同轉(zhuǎn)基因植株之間目的基因的表達(dá)水平。采用定點(diǎn)整合技術(shù)將外源基因定點(diǎn)整合進(jìn)染色體轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)域，降低轉(zhuǎn)基因沉默的發(fā)生率，提高表達(dá)量。另外，優(yōu)化植物表達(dá)載體的構(gòu)成，盡量避免選用相同啟動(dòng)子的同時(shí)驅(qū)動(dòng)外源目的基因、篩選基因和報(bào)告基因，以免發(fā)生同源抑制效應(yīng)。采用低拷貝的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染法也可在一定程度上減少位置效應(yīng)的發(fā)生。

3.1.4 增強(qiáng)外源基因的翻譯效率

可從多個(gè)方面進(jìn)行目的基因的優(yōu)化與改造，適當(dāng)?shù)靥砑又参锾禺惖?’-非翻譯序列、3’-非翻譯序列和內(nèi)含子序列，可增強(qiáng)目的基因產(chǎn)物mRNA的穩(wěn)定性；根據(jù)植物偏愛的密碼子且在不改變氨基酸序列的情況下改造目的基因的密碼子及優(yōu)化起始密碼子周邊序列，都可不同程度地提高外源基因的翻譯效率，提高表達(dá)水平。

3.1.5 葉綠體轉(zhuǎn)化

葉綠體基因組具有高拷貝性，定點(diǎn)整合進(jìn)葉綠體基因組的外源基因一般可得到高效表達(dá)，可在一定程度上克服植物核基因組轉(zhuǎn)化中出現(xiàn)的位置效應(yīng)等引起的外源基因表達(dá)水平低、基因沉默，以及由于外源基因隨基因轉(zhuǎn)化植物花粉擴(kuò)散而帶來的不安全性等問題。馬鈴薯、香蕉等植物轉(zhuǎn)基因后可以進(jìn)行無性繁殖，不需要進(jìn)行純合系篩選，簡(jiǎn)化了育種手續(xù)，可以縮短育種時(shí)間，而且沒有田間雜交的可能性，避免了抗生素等標(biāo)記基因漂移引發(fā)的生物安全性問題。

3.2 增強(qiáng)免疫保護(hù)，避免免疫耐受的策略分析

口服抗原既有誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫反應(yīng)的能力，也能誘導(dǎo)產(chǎn)生口服免疫耐受。接種抗原的劑量是決定引起免疫反應(yīng)或免疫耐受的主要原因。低劑量抗原易引起主動(dòng)抑制，高劑量抗原易引起克隆清除和失能，由于轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的抗原蛋白量通常較低，所以有可能引起低劑量耐受。因此，提高外源基因的表達(dá)量是避免植物口服疫苗引起低劑量免疫耐受的關(guān)鍵策略之一。在實(shí)現(xiàn)外源基因在植物基因轉(zhuǎn)化體中高效穩(wěn)定表達(dá)的基礎(chǔ)上，還可以通過將外源基因表達(dá)產(chǎn)物組裝成類病毒顆粒等以提高抗原的抗消化能力，以及在適宜時(shí)機(jī)添加合適的粘膜免疫佐劑等方法增強(qiáng)植物口服疫苗的免疫保護(hù)能力、減少甚至避免免疫耐受的產(chǎn)生。

3.3 植物基因轉(zhuǎn)化體的遺傳穩(wěn)定性

外源基因在受體植物內(nèi)的遺傳學(xué)行為非常復(fù)雜。大量試驗(yàn)結(jié)果表明，外源基因呈單基因顯性孟德爾分離是其遺傳傳遞中常見的現(xiàn)象，自花授粉后代表現(xiàn)3∶1酌分離規(guī)律，而與非轉(zhuǎn)化親本的雜交后代表現(xiàn)1∶1的分離規(guī)律。目前，常用的有農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA轉(zhuǎn)化、DNA直接轉(zhuǎn)化及生物種質(zhì)轉(zhuǎn)化等方法。DNA直接轉(zhuǎn)化整合的外源基因在后代所呈現(xiàn)的遺傳規(guī)律較復(fù)雜，穩(wěn)定性較差；農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA轉(zhuǎn)化法是人類對(duì)自然界天然遺傳工程的利用，所整合的外源基因的完整性、可預(yù)見性和穩(wěn)定性都優(yōu)于DNA直接轉(zhuǎn)化法，對(duì)能利用該法進(jìn)行轉(zhuǎn)化的植物受體而言是目前所能采用的首選轉(zhuǎn)化方法。

3.4 安全性

雖然我國(guó)目前仍在研究轉(zhuǎn)基因植物的安全性問題，但相信只要措施得當(dāng)，人類還是有能力在不破壞生態(tài)平衡的前提下使轉(zhuǎn)基因植物滿足自身的需求，造福于人類。馬鈴薯、香蕉等植物轉(zhuǎn)基因后可以進(jìn)行無性繁殖，不需要進(jìn)行純合系篩選，簡(jiǎn)化了育種手續(xù)，可以縮短育種時(shí)間，而且沒有田間雜交的可能性，避免了抗生素等標(biāo)記基因漂移而引發(fā)的生物安全性問題。

4.機(jī)遇和挑戰(zhàn)

可飼(食)疫苗除了可以用來防止傳染病的侵染外，還可以用于非傳染性疾病的治療。如利用植物疫苗產(chǎn)生的免疫反應(yīng)來消滅異常發(fā)育的細(xì)胞、惡性腫瘤、減輕自身免疫疾病與過敏反應(yīng)，同時(shí)還可以利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)免疫避孕疫苗來控制某些動(dòng)物的過度繁殖。

目前，在可食用植物疫苗研制過程中存在許多不穩(wěn)定的因素和技術(shù)困難，還有許多已知的和潛在的問題需要進(jìn)一步深入研究。