劉光澤，周 笛，范 沛，顧為望

(1.解放軍第四五八醫(yī)院全軍肝病中心，廣州 510602;2.南方醫(yī)科大學(xué)比較醫(yī)學(xué)研究所，廣州 501515)

研究報(bào)告

人鼠肝組織嵌合體模型的制備

劉光澤1，周 笛2，范 沛2，顧為望2

(1.解放軍第四五八醫(yī)院全軍肝病中心，廣州 510602;2.南方醫(yī)科大學(xué)比較醫(yī)學(xué)研究所，廣州 501515)

目的研究制備人鼠肝組織嵌合小鼠模型。方法將人骨髓干細(xì)胞直接注射到一定日齡胎鼠肝組織，每只注射移植約1×109人骨髓干細(xì)胞。用免疫組化對(duì)出生一定日齡移植小鼠肝臟進(jìn)行甲胎蛋白免疫組織化學(xué)檢測(cè)，檢定分析人肝細(xì)胞在小鼠體內(nèi)嵌合生長(zhǎng)情況。結(jié)果移植人骨髓干細(xì)胞胎鼠出生2月齡、12月齡可檢測(cè)到甲胎蛋白。結(jié)論將人骨髓干細(xì)胞移植小鼠肝臟內(nèi)能夠存活并分化成人肝細(xì)胞并能夠長(zhǎng)期存活。

人鼠嵌合;甲胎蛋白

病毒性肝炎是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的傳染性疾病，長(zhǎng)久以來(lái)一直面臨缺少穩(wěn)定可靠的感染細(xì)胞模型和動(dòng)物模型此大難題，阻礙了對(duì)HBV、HCV致病機(jī)制、抗病毒藥物篩選和疫苗研究等的研究進(jìn)程。近年來(lái)隨著新的生物技術(shù)的迅速發(fā)展，小鼠肝臟嵌合人肝細(xì)胞將為人類(lèi)針對(duì)人體肝臟疾病和肝細(xì)胞病毒的研究提供絕佳的體內(nèi)模型［1］。我們以KM小鼠作為受體，通過(guò)肝臟對(duì)胎鼠移植人骨髓干細(xì)胞，使人的骨髓干細(xì)胞誘導(dǎo)胎鼠產(chǎn)生免疫耐受可在小鼠肝臟內(nèi)長(zhǎng)期存活，使人的骨髓干細(xì)胞在小鼠肝臟內(nèi)增殖，探討建立一種制備人肝組織的嵌合體動(dòng)物模型可能性，從而制備丙型病毒肝炎感染模型。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

KM小鼠購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，由中心SPF實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，合格證號(hào)為2008A071;孕期13～15 d雌性鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。Percoll細(xì)胞分離液購(gòu)自美國(guó)Pharmacia公司、兔抗人AFP多克隆抗體購(gòu)自Invitrogen，編號(hào):18-0055。

1.2 人骨髓干細(xì)胞的移植

1.2.1 人骨髓干細(xì)胞的獲取:取臨床無(wú)血液疾病志愿者髖骨內(nèi)骨髓，密度梯度離心法分離與貼壁法分離人BMSCs。用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并計(jì)算細(xì)胞存活率，臺(tái)盼藍(lán)擔(dān)染法計(jì)算干細(xì)胞存活率，超過(guò)80%用于實(shí)驗(yàn)，所得人骨髓干細(xì)胞的一般達(dá)109。獲取的人骨髓干細(xì)胞立刻進(jìn)行胎鼠肝內(nèi)移植。

1.2.2 胎鼠肝內(nèi)移植:先后選八只孕期為13～15 d的KM小鼠戊巴比妥鈉肌注麻醉，沿小鼠腹白線逐層剪開(kāi)，暴露子宮，此時(shí)肉眼可見(jiàn)子宮內(nèi)胎鼠，因胎鼠皮膚未發(fā)育完全故較透明，可清晰看到腹腔內(nèi)顏色較深部位，即為肝區(qū)。用棉棒輕輕操作，用微量進(jìn)樣器將預(yù)先備好的人骨髓干細(xì)胞逐個(gè)注入胎鼠肝臟內(nèi)，每只的量為5 μL，并用醫(yī)用棉簽按壓注射點(diǎn)止血，注射完畢后，將胎鼠輕輕送回腹腔復(fù)位，縫合創(chuàng)口。自注射后開(kāi)始觀察。

1.3 標(biāo)本采集

對(duì)于小鼠進(jìn)行活體肝臟標(biāo)本采集.具體方法:先將小鼠麻醉，通過(guò)手術(shù)打開(kāi)腹腔，暴露肝組織并切取小部分小鼠肝臟組織，創(chuàng)面迅速灼燒止血。肝組織固定制備成臘塊備用。

1.4 檢測(cè)

免疫組化甲型胎兒蛋白(AFP)簡(jiǎn)稱(chēng)甲胎蛋白的檢測(cè)。按照試劑盒操作說(shuō)明，采用S-P法染色對(duì)小鼠體內(nèi)人肝細(xì)胞的甲胎蛋白進(jìn)行特異性測(cè)定，以人肝組織表達(dá)AFP為陽(yáng)性對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化結(jié)果

用免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，有AFP的存在。結(jié)果肝組織中陽(yáng)性細(xì)胞的AFP主要位于肝細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，呈棕黃色。用免疫組化對(duì)移植人骨髓干細(xì)胞處理獲得的2月齡實(shí)驗(yàn)鼠肝組織人特異AFP檢測(cè)，結(jié)果鼠肝組織可見(jiàn)有散在AFP陽(yáng)性肝細(xì)胞，主要位于肝細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，呈棕黃色，表明有AFP表達(dá);到12月齡再次活體取肝組織進(jìn)行肝組織AFP檢測(cè)，鼠肝組織仍可見(jiàn)到AFP陽(yáng)性肝細(xì)胞，這表明嵌合的人肝細(xì)胞可在鼠肝臟長(zhǎng)期存在(圖1，見(jiàn)彩插Ⅵ)。

2.2 鼠肝內(nèi)移植結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)共注射8只孕期為13～16 d KM孕鼠，其中只有3只孕鼠成功產(chǎn)仔，分別產(chǎn)2只、4只和4只共計(jì)10只仔鼠，移植成功率為37.5%。其他實(shí)驗(yàn)孕鼠注射后第2日或第3日流產(chǎn)，這主要是由于通過(guò)子宮直接對(duì)胎鼠注射易造成較大損傷引起孕鼠流產(chǎn)而失敗。

3 討論

胚胎時(shí)期肝細(xì)胞并未成熟，AFP合成量很高，白蛋白合成量較低，仍處于幼稚狀態(tài)，與成人肝細(xì)胞存在很大差異［2］。既往研究發(fā)現(xiàn)移植的肝細(xì)胞能和宿主肝實(shí)質(zhì)一體化［3］，然而在正常的受體肝臟，移植肝細(xì)胞只能顯示出有限的數(shù)量增長(zhǎng)活性［4］。過(guò)去有關(guān)研究一般選用人肝細(xì)胞、胎肝細(xì)胞。幾年來(lái)干細(xì)胞能在正常肝臟內(nèi)增殖［5］并具有很強(qiáng)的增生性，還可分化成肝細(xì)胞［6］，是肝細(xì)胞移植理想的細(xì)胞之一，所以本研究選用骨髓干細(xì)胞為供體細(xì)胞。

對(duì)新生小鼠移植人骨髓干細(xì)胞或肝細(xì)胞的方法建立人鼠嵌合小鼠，是當(dāng)前肝病研究的一個(gè)重要方向。如果動(dòng)物在胚胎發(fā)育時(shí)期接觸到外來(lái)抗原，它們會(huì)逐漸對(duì)這些抗原產(chǎn)生耐受，允許異種移植物在體內(nèi)中存活［7］。對(duì)嚙齒類(lèi)動(dòng)物的研究結(jié)果表明，制備理想的“嵌合肝”就要從選擇人的何種細(xì)胞為供體、何種動(dòng)物為受體及二者相互作用等因素來(lái)研究。即一方面降低宿主對(duì)移植細(xì)胞的免疫排斥和宿主對(duì)移植細(xì)胞增殖的抑制;另一方面移植細(xì)胞有更強(qiáng)的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，為此我們研究對(duì)胚胎期胎鼠移植干細(xì)胞。人肝細(xì)胞移植到小鼠后重構(gòu)小鼠肝臟對(duì)于分析代謝性或病毒性肝病的基因治療和探討生物機(jī)制大有裨益［8，9］。

AFP是人體胚胎時(shí)期胎兒肝細(xì)胞和卵黃囊內(nèi)合成的一種糖蛋白，胎兒出生1～2周后迅速下降至成人水平(0～20 μg/L)。AFP的生成量和胎兒肝臟或肝細(xì)胞再生時(shí)的分裂細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)，故有人認(rèn)為AFP是由分裂增殖的肝細(xì)胞所產(chǎn)生，也可用于了解肝細(xì)胞再生情況［10，11］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)鼠在2月齡和12月齡進(jìn)行人肝組織特異AFP免疫組織化學(xué)檢測(cè)，均可見(jiàn)有陽(yáng)性細(xì)胞，證實(shí)了小鼠體內(nèi)嵌合有人肝細(xì)胞存在，且表明我們制備的人鼠“嵌合肝”實(shí)驗(yàn)鼠，嵌合鼠肝組織人的細(xì)胞具有人肝細(xì)胞特性。本實(shí)驗(yàn)證明了可以利用人骨髓干細(xì)胞來(lái)制備人鼠“嵌合肝”，并這種“嵌合肝”可持續(xù)至少12個(gè)月時(shí)間。

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The Preliminary Investigation of Human-mouse Liver Chimeric Model Preparation

LIU Guang-ze1，ZHOU Di2，F(xiàn)AN Pei2，GU Wei-wang2
(1.The Liver Disease Centre of PLA，458 th Hospital of PLA，Guangzhou 510602，China; 2.The Institute of Comparative Medicine of South Medical University，Guangzhou 510515，China)

ObjectiveTo establish the human mouse chimeric model of HCV。MethodsThe human bone marrow stem cells were transplanted into each mouse with the number of 1×109via liver to fetal mouse in KM mouse. Testing the AFP in the transplanted mouse liver by immunohistochemistry to analyze the living condition of human liver cell in the mouse body。ResultsAFP was tested after the transplantation of months within its normal value。ConclusionThe human bone marrow stem cells can live and differentiate into the liver cells after transplantation into mouse liver.

Human-mouse chimeric;AFP

R332

A

1671-7856(2010)10-0055-03

10.3969/j.issn.1671.7856.2010.10.015

2010-06-22

廣東省科技項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)A060305004)。