張小飛，葉華虎，趙彥斌，王冬平，趙洪衛(wèi)，白杰英

(軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，北京 100071)

猴B病毒囊膜蛋白gB特異性抗原表位的篩選與表達鑒定

張小飛，葉華虎，趙彥斌，王冬平，趙洪衛(wèi)，白杰英

(軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，北京 100071)

目的 篩選和鑒定猴B病毒囊膜蛋白gB的特異性抗原表位，將其應用于B病毒的檢測。方法 利用蛋白序列比較和表位預測技術篩選猴B病毒囊膜蛋白gB的特異性抗原表位，經(jīng)PCR擴增后原核表達，純化，Western-blot鑒定融合蛋白，建立特異性表位的ELISA檢測方法，并對其效果進行評估。結果 瓊脂糖凝膠電泳和測序結果顯示出目的表位基因完全正確，并且重組蛋白經(jīng)過SDS-PAGE、Western-blot鑒定，其相對分子質(zhì)量約為27×103，與預期值相符。篩選出的gB-26肽表位檢測結果與文獻相符，特異性較好，敏感性稍低。結論 建立了猴B病毒囊膜蛋白gB特異性抗原表位篩選和鑒定的實驗方法，為進一步研制猴B病毒快速診斷試劑盒和猴B病毒亞單位疫苗奠定了基礎。

B病毒;囊膜蛋白gB;抗原表位;篩選;表達

猴B病毒屬于皰疹病毒科，主要存在于亞洲尤其是印度系獼猴屬(恒河猴、食蟹猴、豚尾猴等)動物中［1］。B病毒屬于生物安全4級病原，既是潛在的生物戰(zhàn)劑，又是影響實驗獼猴質(zhì)量及出口的主要疾病，還是獼猴從業(yè)人員以及實驗科技人員安全健康的重要威脅。猴是B病毒的自然宿主，感染率可達10%～60%，多數(shù)情況下呈良性經(jīng)過，僅在口腔黏膜和生殖器黏膜出現(xiàn)皰疹和潰瘍，之后病毒可長期潛伏在三叉神經(jīng)節(jié)和腰骶神經(jīng)節(jié)［2］。人類感染主要表現(xiàn)為腦脊髓炎癥狀，多數(shù)病人死亡。

當前，診斷B病毒感染主要依賴于以全病毒作為抗原的血清學方法，但是，由于B病毒與人單純性皰疹病毒(herpes simple virus，HSV)、猴因子8(simian agent 8 virus，SA8)［3］和狒狒皰疹病毒 4(herpes virus papio 2，HVP-2)具有高度的同源性。以全病毒作檢測抗原，采用快速檢測方法(ELISA、IEA和Dot blot雜交等)［4］，較強的交叉反應難以保證準確性。同源病毒，如HSV-1(國內(nèi)目前使用的抗原)、HSV-2、SA8和HVP-2等，雖不存在嚴重安全隱憂，但假陽性和假陰性已使我國實驗動物業(yè)界蒙受了巨大損失。較強的交叉反應難以保證準確性，因而特異性檢測抗原是當前困擾B病毒快速診斷和有效防治的主要“瓶頸”，無論是B病毒的準確診斷還是有效防治，有效抗原的獲得都是其中的關鍵環(huán)節(jié)。

本研究利用蛋白序列比較和表位預測技術篩選B病毒囊膜蛋白gB的特異性抗原表位，經(jīng)PCR擴增后在大腸桿菌中進行原核表達，表位融合蛋白經(jīng)Ni柱純化和Western-blot鑒定。然后建立該表位的ELISA檢測方法，并對其檢測效果進行評估，為進一步研制B病毒快速診斷試劑盒和B病毒亞單位疫苗奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 相關軟件

DNAMAN生物學分析軟件、DNASTAR生物學分析軟件。

1.2 相關網(wǎng)站

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/，http://www.cbs.dtu.dk/，http://www.immuneepitope.org/。

1.3 質(zhì)粒和菌種

質(zhì)粒pET32-gB為研究室保存。E.coli DH5α、BL21(DE3)為研究室保存。

1.4 試劑和酶

質(zhì)粒提取試劑盒購自TIANGEN(天根)生物技術有限公司，膠回收試劑盒購自WATSON(華舜)生物技術有限公司。耐熱性DNA聚合酶、限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶均是TaKaRa(大連寶生物)工程有限公司的產(chǎn)品。

1.5 儀器和器材

96孔ImmobilizerTM-氨基酶標板(Nunc)購自華美生物技術有限公司。PCR儀(BIO-RAD公司)、水平電泳槽(BIO-RAD公司)、立式電泳槽(BIO-RAD公司)、UVP凝膠成像系統(tǒng)、恒溫搖床(37℃)、培養(yǎng)箱(37℃)、冰箱(4℃、16℃、－20℃、－70℃)、水浴鍋、超凈工作臺等。

1.6 表位合成

BVgD蛋白C端9個氨基酸的多肽GPARRGAPY由上海生工合成，作為陽性對照。BV-gB篩選26個氨基酸的多肽由上海生工合成。

1.7 方法

1.7.1 表位篩選

1.7.1.1 查找猴B病毒囊膜蛋白gB、HSV-1、HSV-2的氨基酸序列:登陸國家生物技術信息中心NCBI(National Center for Biotechnology Information)，查找B virus gB、HSV-1、HSV-2、SA8、HVP-2 等病毒蛋白的氨基酸序列。

1.7.1.2 預測猴B病毒囊膜蛋白gB的信號肽序列:登陸生物序列分析中心 CBS(Center for Biological Sequence Analysis)，分析猴B病毒囊膜蛋白gB的氨基酸序列，預測其信號肽序列的位置。首先，登陸 http://www.cbs.dtu.dk/網(wǎng)站的主頁。然后，打開CBS predication services并且選擇SignalP從而運行SignalP 3.0 Server程序。最后，輸入猴B病毒囊膜蛋白gB的氨基酸序列后點擊運行即可。

1.7.1.3 預測猴B病毒囊膜蛋白gB的胞外區(qū):登陸生物序列分析中心CBS(Center for Biological Sequence Analysis)，分析猴B病毒囊膜蛋白gB的氨基酸序列，預測其胞外區(qū)、跨膜區(qū)、胞內(nèi)區(qū)的位置。首先，登陸http://www.cbs.dtu.dk/網(wǎng)站的主頁。然后，打開CBS predication services并且選擇TMHMM從而運行TMHMM Server v.2.0程序。最后，輸入猴B病毒囊膜蛋白gB的氨基酸序列后點擊運行即可。

1.7.1.4 比較猴B病毒囊膜蛋白gB與HSV-1、HSV-2的特異性:利用DNAMAN生物學分析軟件(也可利用DNASTAR生物學分析軟件)，比較猴B病毒囊膜蛋白 gB與 HSV-1、HCV-2、SA8、HVP-2等的氨基酸同源性。首先，打開DNAMAN生物學分析軟件。然后，運行多重序列比較程序。最后，輸入所要對比的氨基酸序列(如比較猴B病毒囊膜蛋白gB與HSV-1、HCV-2)，點擊運行即可得出氨基酸序列間的相同序列及不相同序列。

1.7.1.5 預測猴B病毒囊膜蛋白gB的抗原表位:登陸抗原表位數(shù)據(jù)庫和分析資源站IEDB(Immune Epitope Database and Analysis Resource)的網(wǎng)站http://www.immuneepitope.org/，利 用 Epitope Prediction and Analysis Tools對猴B病毒囊膜蛋白gB的氨基酸序列進行抗原表位的預測。也可以利用生物序列分析中心CBS的BepiPred 1.0 Server程序或者DNASTAR軟件中的Protean Program來完成抗原表位的預測。

1.7.1.6 篩選猴B病毒囊膜蛋白gB的特異性抗原表位:基于以上氨基酸序列信號肽、跨膜區(qū)的分析結果，同源性的比較結果以及抗原表位的預測結果，從而篩選出猴B病毒囊膜蛋白gB的特異性抗原表位。符合實驗要求的猴B病毒囊膜蛋白gB的特異性抗原表位應滿足以下條件:篩選出的氨基酸序列應該盡量避開信號肽區(qū)域、跨膜區(qū)以及胞內(nèi)區(qū)，并且是不具有同源性的序列，當然更為重要的是經(jīng)抗原表位預測顯示其具有抗原表位。

1.7.2 表位鑒定

1.7.2.1 gB上篩選表位的原核表達:分別根據(jù)目的表位序列設計引物，以陽性質(zhì)粒pET32-gB為模板擴增多個表位序列，經(jīng)酶切、連接、轉化后送至英駿生物公司測序，結果正確后將其插入表達載體pET32b(+)，在 BL21(DE3)內(nèi)原核表達，SDSPAGE檢測蛋白表達水平。

1.7.2.2 Ni柱純化:將以包涵體形式表達的菌體蛋白收集后超生破碎，離心后取菌體沉淀用含2 mol/L尿素的變性液重懸，攪拌溶解2 h;12000 r/min離心20 min;將沉淀用含6 mol/L尿素的變性液重懸，攪拌至溶解;將Ni柱用平衡液平衡，加入變性蛋白液使目的蛋白與Ni柱結合，然后用含咪唑的洗脫液將目的蛋白從柱上洗脫，同時復性蛋白，收集蛋白峰4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7.2.3 用Western-blot對gB表位的特異性進行鑒定:經(jīng)SDS-PAGE電泳后，將凝膠上的蛋白轉印至PVDF膜上，放入含有封閉液的平皿中，封口后4℃封閉過夜。然后用0.1 mol/L的PBS洗滌三次，加入用封閉液配制的1∶1000倍稀釋的His·Tag多克隆抗體，37℃作用1 h，PBS漂洗三次。加入1∶500倍稀釋的辣根酶標記的山羊抗小鼠IgG作為二抗，37℃作用1 h。用PBS漂洗三次。加入DAB顯色液，室溫顯色待觀察到明顯條帶時用純水終止反應。拍攝照片后干燥保存反應膜。

1.7.2.4 gB-26肽表位ELISA方法的建立:96孔ImmobilizerTM-氨基酶標板(Nunc)每孔分別包被100～500 ng gB-26肽和gD-9肽表位合成肽，不蓋蓋，37℃過夜;用100%甲醇室溫固定15 min，每孔100 μL;扣干后用洗滌液洗滌，3×5min;加入封閉液(含3%BSA)室溫封閉 1 h，每孔200 μL;扣干后用洗滌液洗滌，3×5 min;加入稀釋液(含1%BSA)1∶50倍稀釋的待檢血清，每孔 100 μL，37℃ 孵育 90 min;扣干后用洗滌液洗滌，3×5 min;加入稀釋液(含0.02%Tween-20)1∶(4000～12000)倍稀釋的SPA，每孔 100 μL，37℃孵育 40 min;扣干后用洗滌液洗滌，3×5 min;用 OPD顯色，37℃ 15 min;終止液終止反應，酶標儀450 nm讀數(shù)。

1.7.2.5 gB-26肽表位ELISA方法的評估:將人工合成的gB-26肽與gD-9肽分別包被于酶標板上，對相同42份血清進行ELISA檢測，比較其檢測結果1～6列為9肽包被;7～12列為26肽包被(圖1)。A～G排分別加入陽性血清和陰性血清，H排分別加入4份小鼠血清和2份空白對照。

圖1 gB-26肽與gD-9肽ELISA 96孔板加樣示意圖Fig.1 The ELISA microplate delineation of gB-26 peptide and gD-9 peptide

2 結果

2.1 猴B病毒囊膜蛋白gB的信號肽序列

利用生物序列分析中心CBS(Center for Biological Sequence Analysis)的SignalP 3.0 Server程序分析猴B病毒囊膜蛋白gB的氨基酸序列，預測得出其信號肽序列第34和35位氨基酸處。

2.2 猴B病毒囊膜蛋白gB的胞外區(qū)

利用生物序列分析中心CBS(center for biological sequence analysis)的TMHMM Server v.2.0程序，分析猴B病毒囊膜蛋白gB的氨基酸序列，預測得出其胞外區(qū)是第1個氨基酸至第762個氨基酸，跨膜區(qū)是第763個氨基酸至第785個氨基酸、胞內(nèi)區(qū)是第786個氨基酸至第892個氨基酸。

2.3 預測猴B病毒囊膜蛋白gB的抗原表位

利用IEDB網(wǎng)站的Epitope Prediction andAnalysis Tools、DNASTAR軟件中的 Protean Program程序，分別對猴B病毒囊膜蛋白gB的氨基酸序列進行抗原表位的預測。鑒于抗原表位預測結果的準確率在15%～75%之間，因而不同工具的抗原表位預測結果有少許的不同(圖2a，2b，見彩插Ⅲ)。圖2a中橫線上方黃色區(qū)域表示表位可能分布區(qū)域，圖2b中黑線上方紅色區(qū)域表示表位可能分布區(qū)域。

2.4 篩選猴B病毒囊膜蛋白gB的抗原表位

根據(jù)表位預測和猴B病毒囊膜蛋白gB特異性序列分析，從gB蛋白上篩選出gB-24、gB-25、gB-26、gB-284個抗原表位，其氨基酸序列如下:gB 24肽(32-55)aaatpvvsp raspappvpa atptf;25肽(56-80)pdddn dgeagaapga pgtnasveag;26肽(43-68)spappvpa atptfpdddndgeagaap;28肽(453-480)rellreqe rrpgdaaatp kpsadppdve。

2.5 目的表位基因片段的克隆

以陽性質(zhì)粒pET32-gB為模板，經(jīng)PCR擴增后，在用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，出現(xiàn)DNA條帶，約為100 bp，與預期結果相一致(圖3)。

圖3 gB四表位基因片段PCR擴增電泳圖Fig.3 The PCR product of four eiptope of gB

2.6 gB篩選表位的原核表達

將這4個表位核酸片段分別插入原核表達載體pET32b(+)中進行原核表達。轉化BL21(DE3)感受態(tài)細胞進行培養(yǎng)，菌液中加入IPTG至終濃度1mmol/L進行誘導表達，分別于誘導前后進行采樣，最后對處理后的樣品進行SDS-PAGE鑒定，在27×103處出現(xiàn)融合蛋白(圖4)，圖中可見3泳道的gB-26肽表位蛋白量高。

2.7 gB-26肽表位表達蛋白過Ni柱純化

大量培養(yǎng)表達gB-26融合蛋白克隆菌，經(jīng)IPTG誘導后，用Ni柱純化gB-26蛋白變性液，洗脫曲線中有兩個峰，為峰1和峰2，用SDS-PAGE檢測，洗脫液峰2中含有帶His標簽的gB-26融合蛋白 (圖5a)。

圖4 gB四表位SDS-PAGE電泳圖Fig.4 The SDS-PAGE electropherogram of gB four eipitopes

2.8 gB-26肽表位Western-blot鑒定

將gB-26表位純化后融合蛋白SDS-PAGE電泳后，轉移至PVDF膜上，加上His抗體后又棕色條帶出現(xiàn)(圖5b)，表明純化蛋白為目的表位蛋白。

圖5 gB-26表位融合蛋白SDS-PAGE電泳圖(5a)和Western-blot分析(5b)Fig.5 The SDS-PAGE electropherogram(5a)and Western-blot analyses(5b)of gB-26 epitope fusion protein

2.9 gB-26肽表位ELISA檢測方法的建立

用梯度稀釋法，確定了gB-26肽和gD-9肽兩種抗原系統(tǒng)的ELISA方法，最佳工作條件如下:(1)gB-26肽:每孔包被200 ng;酶標抗體1∶10000。(2)gD-9肽:每孔包被100 ng;酶標抗體1∶10000。

2.10 gB-26肽表位ELISA檢測系統(tǒng)的評估

分別以gB-26肽和gD-9肽為包被抗原，檢測猴B病毒抗原片檢測陽性血清和陰性血清各21份，gD-9肽的陽性率為76.2%，陰性率100%;gB-26肽的陽性率為42.9%，陰性率100%。結果表明篩選的gB-26肽表位與文獻報道gD-9肽的陰性檢測結果完全符合，陽性檢測率稍低。

3 討論

近年來，隨著生物信息學的快速發(fā)展，其在表位預測和輔助鑒定方面的作用得到研究者的高度關注和認可，并已獲得一定的發(fā)展和應用。Cha等［5］構建了腫瘤細胞NPLs，通過患者血清中的抗體篩選得到了腫瘤相關抗原表位。篩選自NPLs的表位引起的免疫應答更加接近于蛋白抗原激起的反應［6］。綜合利用分子生物學、生物信息學和免疫學手段篩選出猴B病毒囊膜蛋白gB的抗原表位，對于B病毒診斷和多表位疫苗的研制具有重要意義。猴B病毒囊膜蛋白gB的胞外區(qū)部分是刺激機體產(chǎn)生抗體的有效抗原成分，當然，并不排除抗原的跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)部分在刺激機體產(chǎn)生抗體的過程中也發(fā)揮著一定的作用，但有一點可以肯定的是抗原的胞外區(qū)部分較跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)部分有更好的免疫原性和反應原性，因而我們偏向于在猴B病毒囊膜蛋白gB的胞外區(qū)部分尋找特異性的抗原表位。

表位預測主要依據(jù)蛋白質(zhì)的二級結構、親水性、表面可及性、抗原性指數(shù)以及柔韌性等參數(shù)，預測抗原的表位序列。目前開發(fā)的分析軟件正是基于不同參數(shù)組合形成的數(shù)據(jù)庫，因而預測的結果可能有較大差異。對比不同分析軟件(準確性為15%～75%)的預測結果，既能提高預測的準確性，又盡可能覆蓋所有表位。因此，我們綜合多種分析軟件的預測結果，并結合gB蛋白與其它病毒比較的特異區(qū)域，從而盡可能的提高抗原表位預測的準確性。

在對猴群B病毒抗體檢測中，目前我國使用HSV-1作為BV的替代抗原，廣泛應用于對于實驗猴群B病毒抗體的常規(guī)檢測。雖然B病毒與HSV-1具有共同抗原，B病毒免疫血清可以完全中和HSV-1抗原，但HSV-1免疫血清不能完全中和B病毒［7］。Perelygina以gD的特異性表位(氨基酸序列為GPARRGAPY，位于蛋白序列的362～370氨基酸殘基)合成肽和重組蛋白作為ELISA或dot blot的檢測抗原，特異性為100%，敏感性為67%［8］。肖鏡等［9］進一步對該表位的特異性進行研究，檢測結果與美國實驗室BV抗體檢測結果的符合率達85%。本文中用篩選出的gB-26肽表位作為檢測抗原，與文獻報道gD-9肽表位相比，特異性較強，但陽性檢出率稍低。這提示我們單個表位的抗原性有較大差異，而且表位氨基酸片段大小可能對表位特異性也有關系。在感染動物體內(nèi)，B病毒11種囊膜蛋白(分別為gB～gM)都能檢測到相應的抗體，其中gB、gC、gD和gG的抗體滴度最高、出現(xiàn)時間最早(感染后7 d產(chǎn)生)，在體內(nèi)駐留時間也最長(2年以上)。這提示我們可以進一步篩選特異性表位，并考慮多表位的串聯(lián)來增強其特異性和敏感性。

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［3］Tyler SD，Peters GA，Severini A.Complete genome sequence of cercopithecine herpesvirus 2(SA8)and comparison with other simplex viruses［J］.Virology，2005，331:429－440.

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Selection and Identification of Specific Antigen Epitope in Monkey B Virus Envelop Protein gB

ZHANG Xiao-fei，YE Hua-hu，ZHAO Yan-bin，WANG Dong-ping，ZHAO Hong-wei，BAI Jie-ying
(Laboratory Animal Center，Academy of Military Medical Science，Beijing 100071，China)

Objective To select and identify B virus envelop protein gB specific antigen epitope and to apply to the detection of B virus.Methods Using protein sequence comparison and epitope prediction to select the gB specific antigen eitope.Then obtaining the fusion protein by prokaryon expression and Western-blot assessment，building the ELISA method to detect epitope and evaluating the effects.Results The gene sequence of epitopewas completely correct，the molecular weight of recombination protein identifying by Western-blot was about 27×103.The gB-26 epitide was better in specificity and lower in sensitivity.Conclusion Building up methods to selecet and identify specific antigen eitope.

B virus;Envelop protein gB;Antigen epitope;Selection;Identification

512.92

A

1671-7856(2010)10-0010-05

10.3969/j.issn.1671.7856.2010.10.004

2010-06-25

圖2 Epitope prediction and analysis tools(a)和protean program程序(b)的抗原表位預測結果
Fig.2 The prediction of antigen epitope using epitope prediction and analysis tools(a)and protean program (b)

注：橫軸表示氨基酸數(shù)；a中橫線上方黃色區(qū)域表示表位可能分布區(qū)域，b中黑線上方紅色區(qū)域表示表位可能分布區(qū)域。
Note: horizontal axis means number of animo acids; yelloW area means prediction epitope in a， red area above the black line means prediction epitope in b.

軍事醫(yī)學科學院科研創(chuàng)新基金資助。

張小飛(1979－)，女，博士，主要從事實驗動物微生物學研究。E-mail:wangyizxf@163.com

白杰英(1977－)，男，博士，副主任，主要從事實驗動物免疫與生物化學研究。E-mail:baijieying@126.com