孫兆增，李愛學(xué)，孔德強(qiáng)，趙 爽，趙彥斌，劉 冰，時(shí)彥勝，曾 林

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，北京 100071)

印度尼西亞源食蟹猴干擾素-γ基因的克隆和序列分析

孫兆增，李愛學(xué)，孔德強(qiáng)，趙 爽，趙彥斌，劉 冰，時(shí)彥勝，曾 林

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，北京 100071)

目的 獲得印度尼西亞食蟹猴的干擾素-γ基因，為常用實(shí)驗(yàn)獼猴干擾素-γ的基因工程生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。方法 根據(jù)GenBank上公布的恒河猴干擾素-γ基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，從印度尼西亞食蟹猴的外周血液中分離單核淋巴細(xì)胞，利用Trizol試劑，提取淋巴細(xì)胞的總RNA，通過RT-PCR的方法獲得干擾素-γ基因片段，并對(duì)該片段進(jìn)行克隆、鑒定和序列分析。結(jié)果 擴(kuò)增到一498 bp的目的片段，經(jīng)序列測(cè)定證實(shí)為印度尼西亞食蟹猴的干擾素-γ基因，與恒河猴、人及狒狒的干擾素-γ基因相比，同源性分別為100%、96%、99%。結(jié)論 常用的兩種實(shí)驗(yàn)獼猴食蟹猴與恒河猴的干擾素-γ基因完全相同。

印度尼西亞源食蟹猴;干擾素-γ;克隆;序列分析

干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)是由活化的 T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞在誘生劑的作用下產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子，由于其具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等獨(dú)特作用，在動(dòng)物傳染性疾病的預(yù)防和治療中具有廣闊的應(yīng)用前景［1，2］。自 Isaacs 和 Lindenmann［3］于1957年首次發(fā)現(xiàn)干擾素的存在以來，各種動(dòng)物和類型的干擾素相繼被發(fā)現(xiàn)并克?。?－9］。與其它干擾素類似，IFN-γ生物學(xué)作用有較嚴(yán)格的種屬特異性，如人和小鼠的IFN-γ在DNA水平上有65%左右同源性，在氨基酸水平的同源性只有40%左右［10，11］。

目前在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物疾病防控過程中主要應(yīng)用人源干擾素。恒河猴的IFN-γ由166個(gè)氨基酸組成，與人的同源性為96%。對(duì)于食蟹猴的干擾素-γ基因，國(guó)內(nèi)外的研究報(bào)道較少，本研究擬獲得印度尼西亞食蟹猴的干擾素-γ基因片段，并與其它種屬的干擾素-γ基因序列進(jìn)行比較，為常用實(shí)驗(yàn)獼猴干擾素-γ的基因工程生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

4只印度尼西亞源食蟹猴，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［SCSK-(軍)2002-001］。

1.2 主要試劑

人淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津TBD公司;Trizol購(gòu)自Invitrogen公司;反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV和DEPC為Promega公司產(chǎn)品;凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自杭州 BioFlux公司;LA-Taq、dNTP、Oligo(dT)、pMD18-T克隆載體、EcoRⅠ及HindⅢ內(nèi)切酶均為大連寶生物公司產(chǎn)品;E.coli DH5α感受態(tài)為北京博邁德公司產(chǎn)品。

1.3 引物合成

根據(jù)GenBank上公布的恒河猴的干擾素-γ序列設(shè)計(jì)引物，其上游序列引物為:5′-atgaaatacacaagttatat-3′，下游引物序列為:5′-ttattgggatgctcttcgac-3′，由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。

1.4 外周血單核細(xì)胞的分離和總RNA的提取

無菌采取食蟹猴的外周血各4mL，肝素抗凝。取2mL抗凝血與2mL的Hank’s液充分混合，緩慢加入到2mL淋巴細(xì)胞分離液之上，1500 g離心10 min;去掉上層的水相，將包含淋巴細(xì)胞的中間層全部轉(zhuǎn)移到1.5mL的離心管中，2000 r/min離心10 min，收集淋巴細(xì)胞。用 DEPC水洗滌后，轉(zhuǎn)入到DEPC處理過的離心管中，加入1mL的Trizol，按照Trizol試劑說明書，提取總RNA。

1.5 食蟹猴IFN-γ基因的RT-PCR擴(kuò)增

以提取的總RNA為模版，以olig(dT)為反轉(zhuǎn)錄引物，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)條件為:42℃，1 h;95℃，5 min;4℃，5 min。以2 μL 的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模版，利用LATaq酶擴(kuò)增食蟹猴干擾素-γ基因。反應(yīng)條件為:預(yù)變性95℃，4 min;30 個(gè)循環(huán)，95℃，30 s，54℃，40 s，72℃，1 min;最后 72℃延伸 7 min。利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果，并用凝膠回收試劑盒回收基因片段。

1.6 食蟹猴IFN-γ基因的克隆、鑒定及序列分析

PCR產(chǎn)物回收、純化后，與pMD18-T載體連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑取單個(gè)白色轉(zhuǎn)化菌落，接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，利用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，通過PCR和酶切結(jié)合的方法篩選陽(yáng)性重組子，陽(yáng)性重組子由北京鼎國(guó)生物工程公司測(cè)序。利用DNAMAN軟件編輯測(cè)序序列，并與GenBank上公布的恒河猴、人及狒狒的IFN-γ序列進(jìn)行同源性分析。

2 結(jié)果

2.1 外周血單核細(xì)胞總RNA的提取結(jié)果

利用Trizol試劑從食蟹猴外周血淋巴細(xì)胞中提取到總RNA，rRNA的三條帶比較明顯，沒有明顯的降解(圖1)。

圖1 外周血單核細(xì)胞總RNA的提取結(jié)果Fig.1 The results of total RNA extraction of peripheral blood mononuclear cells

2.2 食蟹猴IFN-γ基因的RT-PCR擴(kuò)增

以食蟹猴外周血單核細(xì)胞中提取的總RNA為模版，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。利用反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模版，從兩只食蟹猴的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中擴(kuò)增到IFN-γ的基因片段，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到長(zhǎng)度約為500 bp的特異性DNA片段(圖2)，與預(yù)期片段的大小一致。

圖2 食蟹猴IFN-γ基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 RT-PCR results of IFN-γ gene of Cynomolgus monkeys

2.3 重組質(zhì)粒的酶切和PCR鑒定

用EcoRⅠ、HindⅢ進(jìn)行重組克隆質(zhì)粒的雙酶切分析，并以重組克隆質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，獲得了兩個(gè)陽(yáng)性重組質(zhì)粒(圖3)。

圖3 IFN-γ陽(yáng)性質(zhì)粒的鑒定結(jié)果Fig.3 Identification of the IFN-γ positive plasmids

2.4 IFN-γ基因的測(cè)序和序列比較

兩個(gè)陽(yáng)性質(zhì)粒序列測(cè)定的結(jié)果表明，食蟹猴IFN-γ全長(zhǎng)為 498 bp，編碼 166個(gè)氨基酸，與GenBank上公布的恒河猴IFN-γ的同源性為100%(序列比對(duì)圖略)，不存在種間差異。與人的IFN-γ相比，同源性為96%;與狒狒的同源性為99%，僅有5個(gè)堿基不同。

3 討論

目前國(guó)內(nèi)共有食蟹猴飼養(yǎng)場(chǎng)39家，其存欄量超過20萬(wàn)只。食蟹猴的疾病防控在其規(guī)?；a(chǎn)中具有重要作用。目前在非人靈長(zhǎng)類獸醫(yī)臨床中多應(yīng)用抗生素等常規(guī)藥物，基因工程藥物應(yīng)用基礎(chǔ)薄弱。基因工程干擾素與血源性干擾素相比，具有無污染、安全性高、純度高、比活性高、成本低、療效確切等優(yōu)點(diǎn)，是應(yīng)用最成功的基因工程藥物。但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)食蟹猴干擾素的研究報(bào)道較少，本研究通過PT-PCR方法對(duì)食蟹猴IFN-γ的序列進(jìn)行了克隆，并進(jìn)行了序列分析，為下一步食蟹猴IFN-γ的基因工程生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

序列分析結(jié)果表明食蟹猴IFN-γ基因序列與恒河猴IFN-γ基因序列完全相同，與人的同源性為96%，與狒狒的同源性為99%，僅有5個(gè)堿基不同。國(guó)內(nèi)外用于實(shí)驗(yàn)的非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物主要包括恒河猴和食蟹猴，本研究表明食蟹猴與恒河猴的IFN-γ基因不存在種間差異，利用本研究獲得的IFN-γ序列進(jìn)行基因工程生產(chǎn)，可廣泛應(yīng)用到非人靈長(zhǎng)類的獸醫(yī)臨床中。

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Cloning and Sequence Analysis of Interferon-γ of Indonesian Cynomolgus Monkeys

SUN Zhao-zeng，LI Ai-xue，KONG De-qiang，ZHAO Shuang，ZHAO Yan-bin，LIU Bing，SHI Yan-sheng，ZENG Lin
(Laboratory Animal Center of the Academy of Military Medical Science，Beijing 100071，China)

Objective To obtain the IFN-γgene of Indonesian Cynomolgus monkeys and provide a theoretical and material basis for the production of the recombinant IFN-γ.Method Based on the published nucleotide sequence of IFN-γ gene of rhesus monkey in GenBank，a pair of RT-PCR primers were designed and synthesized.Total RNA，isolated from the peripheral blood mononuclear cells by Trizol，was used as template to amplify the IFN-γgene by RT-PCR.The gene was identified by endonuclease，PCR and DNA sequencing.Result A 498 bp DNA fragments were amplified.DNA sequencing confirmed that the fragment was IFN-γof Cynomolgus monkeys.Compared with rhesus monkeys，humans and baboons，the homology of nucleotide sequence of IFN-γgene were 100%，96%and 99%respectively.Conclusion The IFN-γ gene of cynomolgus monkey was identical to that of rhesus monkey.

Indonesian Cynomolgus monkeys;IFN-γ;Cloning;Sequence analysis

R349.64

A

1671-7856(2010)10-0003-03

10.3969/j.issn.1671.7856.2010.10.002

2010-06-12

國(guó)家自然基金(30970416)，國(guó)家科技部基礎(chǔ)平臺(tái)項(xiàng)目(2005DKA21500)。

孫兆增(1977－)男，博士，研究方向:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)。

曾林(1965－)男，研究員，研究方向:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)與管理。