陳琳,黃紅云

近年來,骨髓基質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)干/祖細(xì)胞、嗅鞘細(xì)胞、神經(jīng)元等已應(yīng)用于腦卒中臨床治療研究,初步結(jié)果令人振奮,本文就這方面的研究進(jìn)展簡述如下。

1 骨髓基質(zhì)細(xì)胞(MSCs)

1.1 細(xì)胞制備、植入途徑及聯(lián)合其他療法 Bang等取5 ml骨髓,用Ficoll密度離心法分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞,1×106/ml接種于底部面積為175 cm2燒瓶,在低葡萄糖Dulbecco modified eagles'培養(yǎng)基中培養(yǎng),其中含10%牛血清、1%青霉素/鏈霉素,孵育在恒濕37℃,5%CO2培養(yǎng)器內(nèi)。5 d后更換培養(yǎng)液,去除非黏附細(xì)胞。黏附細(xì)胞在5～7 d內(nèi)生長形成集落。當(dāng)原代MSCs達(dá)到80%融合后,0.25%胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。每例患者的標(biāo)本在23～37(30.8±5.5)d培養(yǎng)擴(kuò)增到 1×108個(gè)細(xì)胞(按照體重參照,每只大鼠1×105～3×106)。臨床使用前用胰蛋白酶消化,磷酸緩沖液洗滌,10 ml鹽水重懸,生理鹽水稀釋到50～80 ml,在15～20 min內(nèi)靜脈輸注。細(xì)胞量每次 5×107,發(fā)病后4～5周首次植入,7～9周第2次植入[1]。

鄧志鋒等抽取自體骨髓細(xì)胞懸液,在體外經(jīng)過分離培養(yǎng)后,制成骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞懸液,通過靜脈輸注方式移植腦內(nèi):抽取自體骨髓懸液約80～100 ml,注入含肝素抗凝無菌玻璃瓶中,于無菌超凈臺(tái)離心,取自體血漿備用;骨髓細(xì)胞沉淀用等量的林格氏液稀釋后加至淋巴細(xì)胞分離液上離心分離,吸取中間毛玻璃樣的單核細(xì)胞層加至林格氏液離心洗滌3次,加約20 ml備用血漿和80 ml林格氏液稀釋細(xì)胞,用吸管輕輕吹打,制成單細(xì)胞懸液分離出單個(gè)核細(xì)胞(可定向分化的干細(xì)胞)懸液。用帶4號(hào)針頭的注射器抽取細(xì)胞懸液,注入無菌輸液袋中,將無菌輸液袋在熱合機(jī)下嚴(yán)密封口后,送至病房備移植用,同時(shí)取少許細(xì)胞懸液滴在血培養(yǎng)皿中做無菌實(shí)驗(yàn)。另外預(yù)留部分自體骨髓干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增,制備成細(xì)胞懸液用于再次進(jìn)行自體骨髓干細(xì)胞移植。細(xì)胞移植前30 min,給予20%甘露醇125 ml快速靜滴,增加血腦屏障通透性。細(xì)胞量為2×107～1.7×108,移植1～2次[2]。

1.2 療效 Bang等進(jìn)行了一項(xiàng)對(duì)培養(yǎng)擴(kuò)增的自體MSCs治療缺血性卒中患者前瞻性臨床試驗(yàn),試驗(yàn)共納入30例伴有嚴(yán)重神經(jīng)功能缺損的大腦中動(dòng)脈梗死患者,隨機(jī)分為2組。MSC治療組(n=5)在發(fā)病1個(gè)月之后接受1×108個(gè)自體MSCs靜脈輸注;對(duì)照組(n=25)不接受MSC治療。盡管MSC的數(shù)量巨大,而且這些細(xì)胞經(jīng)過了體外擴(kuò)增,但并未出現(xiàn)任何急性或遲發(fā)性毒性反應(yīng)。在發(fā)病后1年內(nèi)對(duì)兩組患者的神經(jīng)功能缺損評(píng)分和功能改善方面進(jìn)行比較,每組對(duì)5例患者進(jìn)行連續(xù)影像學(xué)檢查。結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,MSC治療組患者轉(zhuǎn)歸明顯較好,MSC組患者在隨訪期間的 Barthel指數(shù)(3、6和12個(gè)月時(shí))和改良Rankin量表評(píng)分(3、6和12個(gè)月時(shí))都有明顯改善。M RI檢查表明,MSC組包括梗死周圍區(qū)在內(nèi)的全腦萎縮明顯減輕,這說明MSC能夠擴(kuò)散至整個(gè)腦組織中。連續(xù)評(píng)價(jià)表明,MSC治療沒有細(xì)胞治療相關(guān)的、血清學(xué)或影像學(xué)上的不良反應(yīng)[1]。

鄧志鋒等用自體骨髓基質(zhì)細(xì)胞通過靜脈移植治療5例中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后神經(jīng)功能障礙患者(腦卒中患者3例,腦外傷術(shù)后患者2例,最早7天,最長6個(gè)月)。移植治療后所有患者均未見不良反應(yīng)。出院0.5年后隨訪,最長隨訪時(shí)間達(dá)2年。5例患者神經(jīng)功能缺損癥狀較移植前均有很大程度改善,其中2例神志不清患者神志恢復(fù),可按吩咐動(dòng)作;4例患者肌力提高1～3級(jí);失語癥狀均得到一定改善[2]。

2 神經(jīng)干/祖細(xì)胞

2.1 細(xì)胞制備、植入途徑及聯(lián)合其他療法 楊清成等收集6～8周流產(chǎn)胚胎,取腦室區(qū)和室下區(qū)細(xì)胞,2.5 g/L胰蛋白酶消化,500～800 r/min離心4 min,DMEM-F12∶B27=50∶1加入。細(xì)胞懸浮培養(yǎng)(密度5×108)在 bFGF(20 μ g/L)培養(yǎng)基。在 37℃,500 ml/L CO2濃度培養(yǎng)5～6代。每次使用4×106個(gè)細(xì)胞,采用鞘內(nèi)注射將細(xì)胞懸液注入蛛網(wǎng)膜下腔,通過腦脊液循環(huán)至大腦表面,個(gè)別病例通過引流管將細(xì)胞懸液注射到腦損傷處[3]。

張儒有等取孕12～14周流產(chǎn)胎兒的腦組織,徹底剝離腦組織表面的軟腦膜和血管,將腦組織剪碎,120目銅網(wǎng)過濾后接種于75 cm 培養(yǎng)瓶,細(xì) 胞培養(yǎng)液為 含 30 μ g/L bFGF、20 μ g/L表皮生長因子、1%B27的DM EM/F12(1∶1)。細(xì)胞置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2的培養(yǎng)箱中。體外連續(xù)培養(yǎng)和傳代增殖。移植前將神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)成神經(jīng)前體細(xì)胞。移植1次/周,共3次,通過腰椎穿刺蛛網(wǎng)膜下腔植入[4]。

盧旺盛等[5]取孕8～10周自然流產(chǎn)的胎兒(原文技術(shù)細(xì)節(jié)記錄不詳),采用立體定向技術(shù),選取病灶側(cè)腦軟化區(qū)作為移植靶點(diǎn),先在靶區(qū)注入地塞米松3 mg,然后用微量泵將3×107細(xì)胞(共0.3 ml)緩慢注入靶點(diǎn)。

2.2 療效 楊清成等報(bào)道23例腦卒中患者,病程3個(gè)月～30年,以歐洲卒中量表評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(European stroke scale,ESS)提高1分以上為有效,結(jié)果中,19例有效,4例無效;移植后ESS評(píng)分、Barthel指數(shù)均提高[3]。隨后又報(bào)道59例患者治療結(jié)果,12例患者術(shù)后24 h內(nèi)出現(xiàn)一過性發(fā)熱,體溫37.4℃～38.5℃,給予對(duì)癥處理后體溫漸降;6例患者術(shù)后感輕微頭痛。24個(gè)月后隨訪,患者頭顱CT、MRl、心電圖、肺片及血液生化學(xué)指標(biāo)均未發(fā)現(xiàn)異常;51例有效,8例無效;移植后ESS平均提高(2.7±2.5)分[6]。

張儒有等報(bào)道50例患者,末次發(fā)病至接受神經(jīng)干細(xì)胞移植時(shí)間平均為3.4年,其中基底節(jié)病變39例,腦干病變3例,其他部位(丘腦、大腦半球)8例,累計(jì)多部位的病變6例。移植后6個(gè)月功能獨(dú)立性評(píng)分(FIM)顯著高于移植前[4]。

盧旺盛等[5]報(bào)道16例腦出血患者采用立體定向技術(shù),選取病變側(cè)基底節(jié)區(qū)作為靶點(diǎn)進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞移植術(shù),于治療前、治療后1個(gè)月、6個(gè)月進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分和FIM。結(jié)果接受神經(jīng)干細(xì)胞移植的腦出血患者無嚴(yán)重手術(shù)并發(fā)癥。手術(shù)后6個(gè)月內(nèi)臨床癥狀改善有效率81.25%(13/16),FIM評(píng)分在6個(gè)月內(nèi)持續(xù)升高。

3 嗅鞘細(xì)胞

3.1 細(xì)胞制備、植入途徑及聯(lián)合其他療法 黃紅云等取3～4個(gè)月流產(chǎn)胚胎嗅球,解剖鏡下仔細(xì)剝離嗅球表面的軟膜和血管組織,Hanks液沖洗2遍,剪成0.5～1 mm3大小,0.25%胰酶消化15 min,輕輕吹打使之形成細(xì)胞懸液;離心去除上清液(1200 r/min,5 min,室溫)。稀釋細(xì)胞濃度至106/ml,種植于無包被處理25 cm2培養(yǎng)瓶內(nèi),置CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)(37℃)。細(xì)胞純化采用Nash差速貼壁法結(jié)合阿糖胞苷抑制法,在培養(yǎng)24 h后輕輕吹打?qū)⒓?xì)胞懸液吸出移入另一個(gè)無菌培養(yǎng)瓶,按106/ml接種到包被聚賴氨酸的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)。同時(shí)加入阿糖胞苷0.6 μ l/ml,48 h后80%換液。每 3 d換液 1次至14 d。每例定向微創(chuàng)手術(shù)移植2×106/100 μ l腦軟化區(qū)周邊或放射冠錐體束走行處(單靶點(diǎn)或2個(gè)靶點(diǎn))[7-8]。

3.2 療效 黃紅云等報(bào)道7例患者,病程0.6～14.3年。缺血性卒中4例,出血性卒中3例。病變位于基底節(jié)和大腦半球6例,延髓1例。術(shù)后2周ADL評(píng)分增高,臨床神經(jīng)功能評(píng)分改善。癥狀改善主要包括語言、肢體肌力增加、高肌張力降低、平衡改善、疼痛減輕、呼吸改善。2例獲得2年以上隨訪,1例43歲意大利籍女性,左基底核及額葉腦梗死3年接受細(xì)胞治療。術(shù)后2年隨訪,患者言語較前流利,可說完整的句子;行走不再需要支具,步態(tài)基本正常;Barthel指數(shù)總分由70分增至90分,其中行走由0分增至15分,上下樓梯由 0分增至5分。另1例87歲中國籍女性患者,因腦梗死致記憶力下降1年,言語障礙、右側(cè)肢體運(yùn)動(dòng)障礙6個(gè)月接受手術(shù),2年隨訪,行走功能、反應(yīng)能力和言語繼續(xù)改善[9-10]。

4 人神經(jīng)元細(xì)胞

Kondziolka等對(duì)12例患者伴有運(yùn)動(dòng)功能障礙基底節(jié)區(qū)卒中行神經(jīng)元(human neuronal cells,hNT cells)腦內(nèi)移植,年齡44～75歲,病史6個(gè)月～6年(至少功能穩(wěn)定2個(gè)月)。隨訪12～18個(gè)月,未發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞移植有關(guān)神經(jīng)功能損害,6例患者ESS提高 3～10分,全部患者平均提高2.9分。6個(gè)月時(shí),PET掃描有6例患者移植區(qū)糖代謝增加[11]。后他們又報(bào)道神經(jīng)元細(xì)胞注射到26例患者的基底節(jié)卒中區(qū)或周邊。手術(shù)當(dāng)天早晨,細(xì)胞冷凍融化。使用專門設(shè)計(jì)的細(xì)胞植入套管,第1批患者植入2×106或6×106個(gè)細(xì)胞,通過 3或 9個(gè)點(diǎn)植入;第2批患者植入5×106或 1×107個(gè)細(xì)胞,通過25個(gè)點(diǎn)植入。植入時(shí)間2 h。除1例由于慢性硬膜下血腫行引流手術(shù)外,其他無手術(shù)并發(fā)癥。最長隨訪5年,無細(xì)胞相關(guān)血清學(xué)和CT/MRI影像學(xué)異常改變,細(xì)胞保持活力[12]。還報(bào)道了9例腦卒中后2年以上的患者,其中2例為對(duì)照。神經(jīng)細(xì)胞腦內(nèi)移植6個(gè)月后評(píng)估,

4 例認(rèn)知功能改善[13]。

Meltzer等對(duì)12例慢性基底節(jié)梗死并有運(yùn)動(dòng)障礙后遺癥的患者在細(xì)胞移植前1周、移植后6和12個(gè)月行18F-脫氧葡萄糖正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描(FDG-PET)檢查。結(jié)果顯示,移植組卒中灶及其周圍糖代謝活性有運(yùn)動(dòng)改善相關(guān)的提高[14]。Nelson等報(bào)道1例腦卒中患者腦內(nèi)移植畸胎瘤細(xì)胞系(hNT)神經(jīng)細(xì)胞,27個(gè)月后尸檢發(fā)現(xiàn)仍有大量存活細(xì)胞(神經(jīng)微絲免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元),熒光原位雜交檢查顯示無腫瘤形成[15]。

5 其他細(xì)胞

Rabinovich等經(jīng)腰穿移植未成熟神經(jīng)系統(tǒng)和血液系統(tǒng)細(xì)胞懸液治療10例患者,手術(shù)后6個(gè)月所有治療患者都有不同程度的神經(jīng)功能改善,與對(duì)照組相比有顯著性差異[16]。Savitz等[17]為5例腦卒中患者移植豬胚胎細(xì)胞,手術(shù)前對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫處理,患者沒有服用免疫抑制劑,手術(shù)后1周,1例患者出現(xiàn)癲癇,1例患者出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)障礙持續(xù)3周,其他患者沒有不良反應(yīng);2例患者運(yùn)動(dòng)和語言改善,并持續(xù)超過4年。

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