王文,許棟明,相婕,李蕾,王培昌,艾厚喜,張麗,李林

缺血性腦損傷是危害人類健康的三大疾病之一。我國居民第三次死因調(diào)查結(jié)果顯示,腦血管病已成為我國第1位的死亡原因,死亡率高于歐美國家4～5倍,目前臨床上缺少有效的腦保護(hù)藥。中藥治療腦血管病有確切的臨床療效。我們從中藥山茱萸篩選到有效成分莫諾苷,前期細(xì)胞試驗(yàn)表明,對神經(jīng)細(xì)胞SY5Y具有抑制過氧化氫損傷、抑制細(xì)胞凋亡、鈣超載等作用[1-9],有提高局灶性腦缺血再灌注大鼠皮層總抗氧化能力的作用[10]。本試驗(yàn)研究莫諾苷對局灶性腦缺血再灌注大鼠皮層超氧化物歧化酶及神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 莫諾苷由本室從山茱萸中提取制備,HPLC分析純度大于98.5%。維生素E(VE):北京雙鶴藥業(yè)。超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒:南京建成生物工程研究所(批號:20081102)。其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物分組及給藥 72只SPF級Wistar雄性成年大鼠,體重260～280 g,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司,合格證編號:SCXK(京)2007-0001。隨機(jī)分為假手術(shù)組,模型組,莫諾苷小(30 mg/kg)、中(90 mg/kg)、大(270 mg/kg)劑量組和維生素E組(35 mg/kg),每組12只。采用線栓法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型,術(shù)后一半動物連續(xù)灌胃給藥3 d,另一半連續(xù)灌胃給藥7 d,每天給藥1次。

1.3 模型制備 局灶性腦缺血再灌注模型采用改良Zea Longa線栓法[3]制備。大鼠用10%水合氯醛0.35 ml/kg腹腔注射麻醉,仰臥位固定于鼠板上,頸部正中切口,鈍性分離右側(cè)頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈,結(jié)扎頸外動脈和頸總動脈的近心端,動脈夾與頸總動脈近心端之間結(jié)扎一道縫合線,不扎緊。在頸總動脈接近頸外動脈和頸內(nèi)動脈分叉處用眼科剪作一斜行細(xì)切口,將直徑為0.26 mm的尼龍線插入,稍扎緊縫合線,推動尼龍線進(jìn)入頸內(nèi)動脈,進(jìn)入距頸外動脈和頸內(nèi)動脈分叉處約2 cm時(shí),會有阻擋感,說明栓線已越過大腦中動脈,到達(dá)大腦前動脈的起始部。記錄栓塞開始時(shí)間,結(jié)扎頸總動脈上端?？p合肌肉、皮膚。栓塞后2 h,若此時(shí)大鼠已蘇醒則需要再次將大鼠麻醉,并拔出尼龍線。假手術(shù)組的大鼠除不插入尼龍線外,其他操作與手術(shù)組相同。

1.4 模型成功及評價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 參照 Longa及Bederon的5分制評分方法[3-4]對實(shí)驗(yàn)動物的神經(jīng)行為學(xué)進(jìn)行評分。0分:無神經(jīng)系統(tǒng)損傷癥狀;1分:不能完全伸展對側(cè)前爪;2分:向左側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分:向?qū)?cè)傾斜;4分:不能自發(fā)行走,意識喪失。將0分、1分及4分大鼠剔除并補(bǔ)充各組設(shè)計(jì)所需大鼠數(shù)量。

1.5 SOD測定 腦缺血再灌注后3 d迅速斷頭取腦,冰生理鹽水快速漂洗,徹底去除標(biāo)本表面血液后,于冰盤上分離患側(cè)腦皮層組織。將大鼠患側(cè)腦皮層組織在電子天平上稱重后,用高速電動勻漿器在低溫下制成10%組織勻漿液。置低溫高速離心機(jī)內(nèi),12000 r/min離心30 min。SOD檢測按照試劑盒說明書進(jìn)行,并按試劑盒提供的公式進(jìn)行計(jì)算。

1.6 Nissl染色 再灌注7 d大鼠用體積分?jǐn)?shù)為0.04的甲醛行心臟灌注,取腦組織行石蠟包埋。組織切片經(jīng)脫蠟、逐級乙醇脫水及水洗后,加入緩沖亞甲蘭染液10 min,0.2 M乙酸鹽緩沖液(pH=4.6)分色2 min。陽性染色者胞核淡染,胞質(zhì)呈藍(lán)色,即存活的神經(jīng)元。

2 結(jié)果

2.1 SOD 模型組皮層SOD活性降低;與模型組相比,莫諾苷大劑量和VE組SOD活性顯著升高(P＜0.01,圖 1)。

2.2 腦神經(jīng)元 模型組神經(jīng)元數(shù)量明顯下降;與模型組比較,莫諾苷各組能明顯提高神經(jīng)元數(shù);VE組與模型組無顯著性差異(圖2)。

3 討論

缺血性腦血管病具有發(fā)病率高、死亡率高、致殘率高的特點(diǎn)。尋找有效的預(yù)防措施以減少發(fā)病率、有效的腦保護(hù)措施以減少死亡率以及有效的再生修復(fù)措施以減少其致殘率和致殘程度是研究的關(guān)鍵。

缺血性腦損傷在急性期主要是由于能量障礙引起氧化應(yīng)急、鈣超載、興奮性氨基酸毒性,造成腦損傷。在這一階段,抗氧化、抑制鈣超載和興奮性氨基酸毒性是治療的關(guān)鍵問題。人體抗氧化主要有兩種方式,小分子抗氧化物質(zhì)和抗氧化酶,其中由于氧化應(yīng)激而誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗氧化酶在這個(gè)過程中起著重要作用,它是體內(nèi)抗氧化能力的重要反應(yīng)。缺血再灌注3 d基本上能夠反映藥物在急性期抗氧化能力。本研究顯示,大劑量莫諾苷和經(jīng)典的抗氧化劑VE一樣,表現(xiàn)出很好的抗氧化活性,顯示有良好的應(yīng)用前景。

腦缺血/再灌注損傷在急性期另外一個(gè)病理過程是引起神經(jīng)元的死亡和凋亡,造成神經(jīng)元大量減少,造成神經(jīng)功能障礙。本研究顯示,大鼠腦缺血/再灌注后,口服莫諾苷7 d,可以抑制神經(jīng)元數(shù)量的減少,有神經(jīng)保護(hù)作用;而VE沒有抑制神經(jīng)元減少的作用,表明莫諾苷在抑制氧化應(yīng)激外,另有其他機(jī)理產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用,值得進(jìn)一步探討。

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